土壤中不同有機(jī)組分的連續(xù)提取方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種土壤中不同有機(jī)質(zhì)組分的連續(xù)提取方法，包括顆粒有機(jī)質(zhì)(POM)、顆粒態(tài)黑炭(POM?BC)、胡敏酸(HA)、富啡酸(FA)、易提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白(EE?GRSP)、難提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白(HE?GRSP)、檸檬酸鈉易提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)(EE?DOC)、檸檬酸鈉難提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)(HE?DOC)、殘余態(tài)有機(jī)質(zhì)(Residual)以及結(jié)合態(tài)黑炭(B?BC)的連續(xù)提取。主要步驟如下：(1)土壤樣品的采集與預(yù)處理；(2)試劑的配置；(3)不同有機(jī)組分的連續(xù)提取；(4)提取出有機(jī)組分碳含量的測(cè)定；(5)不同有機(jī)組分碳含量的計(jì)算。本發(fā)明將不同的有機(jī)組分連續(xù)提取與分離出來(lái)，克服了傳統(tǒng)方法每次只能提取一種有機(jī)組分以及提取出不同有機(jī)組分之間物質(zhì)重疊的問(wèn)題，同時(shí)提高了土壤中有機(jī)質(zhì)的提取率。
【專利說(shuō)明】
土壤中不同有機(jī)組分的連續(xù)提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域中一套土壤有機(jī)質(zhì)組分的分離提取方法。具體的說(shuō)就是一套將土壤有機(jī)質(zhì)的不同組分，顆粒有機(jī)質(zhì)(Ρ0Μ)、顆粒態(tài)黑炭(P0M-BC)、胡敏酸(HA)、富啡酸(FA)、易提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白(EE-GRSP)、難提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白(HE-GRSP)、檸檬酸鈉易提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)(EE-DOC)、檸檬酸鈉難提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)(HE-D0C)、殘余態(tài)有機(jī)質(zhì)(Residual)以及結(jié)合態(tài)黑炭(B-BC)，通過(guò)連續(xù)提取將其分離，并測(cè)定不同組分碳含量的方法。
技術(shù)背景
[0002]土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)是土壤的重要組成物質(zhì)，對(duì)改善土壤物理化學(xué)性質(zhì)以及植物的生長(zhǎng)起著重要的作用，同時(shí)也是全球碳循環(huán)的一個(gè)重要因素，在環(huán)境保護(hù)、農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面有著重要的意義。通過(guò)物理和化學(xué)分離手段可以將土壤有機(jī)組分分為顆粒有機(jī)質(zhì)、富啡酸、胡敏酸、胡敏素、土壤球囊霉素相關(guān)蛋白以及黑炭。
[0003]顆粒有機(jī)質(zhì)由大量來(lái)至植物根部的新鮮植物殘?bào)w組成，這是植物殘?bào)w分解最先形成的碳庫(kù)，也是土壤系統(tǒng)中能量與營(yíng)養(yǎng)的來(lái)源。顆粒有機(jī)質(zhì)的提取方法是在加入高密度的碘化鈉或多鎢酸鈉溶液，利用物理方法將其懸浮和土壤分離。胡敏酸和富啡酸是土壤動(dòng)植物殘?bào)w被微生物分解的副產(chǎn)品。利用氫氧化鈉和焦磷酸鈉溶液對(duì)土壤進(jìn)行提取后，提取液用稀硫酸酸化進(jìn)行沉淀，發(fā)生沉淀的物質(zhì)是胡敏酸，溶液中未沉淀的物質(zhì)是富啡酸。球囊霉素相關(guān)蛋白是由叢植菌根真菌產(chǎn)生的一種糖蛋白。利用檸檬酸鈉溶液在提取溫度為121°C的條件下將其提取，然后用鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值到2.1使其沉淀，得到的沉淀物就是球囊霉素相關(guān)蛋白，溶液中沒(méi)有沉淀的物質(zhì)是檸檬酸鈉可提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)。土壤中黑炭的提取是利用鹽酸和氫氟酸反復(fù)處理樣品，充分去除土壤中的碳酸鹽和硅酸鹽，最后使用重鉻酸鉀和硫酸混合溶液處理，最后的殘余物質(zhì)就是黑炭。土壤胡敏素是既不溶于酸又不溶于水的腐殖物質(zhì)組分，將土壤用氫氧化鈉和焦磷酸鈉混合液反復(fù)浸提除去其中的胡敏酸和富啡酸，剩余的殘?jiān)褪呛羲亍?br>[0004]現(xiàn)有的通過(guò)用不同提取劑將土壤有機(jī)質(zhì)的不同組分分離提取出來(lái)的傳統(tǒng)方法只能分離或提取土壤有機(jī)質(zhì)中的一種或幾種組分，不能完全將所有的已知土壤有機(jī)質(zhì)組分分離出來(lái)。因此，設(shè)計(jì)一套能夠?qū)⒁阎乃型寥烙袡C(jī)質(zhì)組分進(jìn)行系統(tǒng)、連續(xù)提取和分離的方法，對(duì)于土壤有機(jī)質(zhì)的研究是一項(xiàng)基礎(chǔ)性的工作，有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)傳統(tǒng)土壤有機(jī)質(zhì)組分的提取與分離的方法只能提取與分離部分土壤有機(jī)質(zhì)組分的問(wèn)題，設(shè)計(jì)出一種土壤中不同有機(jī)組分的連續(xù)提取方法，即連續(xù)分離土壤有機(jī)質(zhì)的物理與化學(xué)組分的方法。
[0006]本發(fā)明所述的土壤中不同有機(jī)組分的連續(xù)提取方法的連續(xù)提取步驟為:
[0007]—、土壤樣品的采集與預(yù)處理；
[0008]二、試劑的配制；
[0009]三、不同有機(jī)組分的連續(xù)提??；
[0010]所述不同有機(jī)組分的連續(xù)提取包括如下步驟:
[0011]a.游離態(tài)顆粒有機(jī)質(zhì)和游離態(tài)黑炭的混合物的提取:取土樣2.5克到50ml塑料離心管中，加入20ml密度為1.7g/cm3的碘化鈉溶液，振蕩I小時(shí)，5600轉(zhuǎn)離心20分;這種操作重復(fù)3次，直到懸浮液中沒(méi)有懸浮物質(zhì)為止;懸浮物質(zhì)在0.7um的濾紙下過(guò)濾，用真空栗抽干，先用70ml左右0.0lmoVL的氯化鈣沖洗，再用去離子水洗直到電導(dǎo)率<50yS/cm;樣品轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中，離心管中殘余土保留以便下一步提??；測(cè)定提取物碳含量時(shí)應(yīng)把轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干；
[0012]b.閉蓄態(tài)顆粒有機(jī)質(zhì)和閉蓄態(tài)黑炭的混合物的提取:將上一步提取的殘余土，加入20ml密度為1.7g/cm3的碘化鈉溶液，用450 J/ml的超聲波處理I小時(shí)，溫度控制在40 °C以下，5600轉(zhuǎn)離心20分；這種操作重復(fù)3次，直到懸浮液中沒(méi)有懸浮物質(zhì)為止；懸浮物質(zhì)在0.7um的濾紙下過(guò)濾，用真空栗抽干，先用70ml左右0.01mol/L的氯化鈣沖洗，再用去離子水洗直到電導(dǎo)率〈50yS/cm;樣品轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中，離心管中殘余土用去離子水洗洗滌，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，此操作重復(fù)3次，保留以便下一步提取;測(cè)定提取物碳含量時(shí)應(yīng)把轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干；
[0013]c.顆粒態(tài)黑炭POM-BC的提取:將步驟a和步驟b得到的混合物合并，加入6ml重鉻酸鉀和硫酸的混合液，其中重絡(luò)酸鉀的濃度為0.lmol/L，硫酸的濃度為2mol/L，在溫度為55土I °C的條件下反應(yīng)60小時(shí)，用去離子水沖洗轉(zhuǎn)入離心管中，5000轉(zhuǎn)離心20分鐘，棄去上清液，用去離子水清洗3次，剩余物質(zhì)就是P0M-BC;測(cè)定提取物碳含量時(shí)應(yīng)把轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干；
[OOM] d.胡敏酸HA和富啡酸FA的提取:在步驟b的殘余土中加入0.lmol/L的焦磷酸鈉和0.lmol/L的氫氧化鈉混合液20ml，通入氮?dú)?分鐘，震蕩12小時(shí);4500轉(zhuǎn)離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)入10ml容量瓶中，這一步驟重復(fù)3-5次，直到上清液無(wú)色為止，定容，此時(shí)容量瓶中收集的物質(zhì)為腐殖酸:胡敏酸和富啡酸;吸取濾液40ml于燒杯中，置于沸水浴上加熱，在玻璃棒攪拌下滴加3mol/L的硫酸溶液酸化，直至有絮狀沉淀為止，繼續(xù)加熱10分鐘使胡敏酸完全沉淀；以0.02mol/L的硫酸溶液洗滌濾紙和沉淀，洗至濾液無(wú)色為止，濾液為富啡酸，用150ml三角瓶收集；以熱的0.02mol/L氫氧化鈉溶液溶解沉淀，溶解液收集于150ml三角瓶中，如前法酸化;胡敏酸和富啡酸溶液60°C條件下水浴蒸干，以便下一步測(cè)定碳含量;離心管中殘余土用去離子水洗洗滌，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，此操作重復(fù)3次，保留以便下一步提?。?br>[0015]e.易提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白EE-GRSP和檸檬酸鈉易提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)EE-DOC的提取:上述殘余土中加入20ml濃度為0.02mol/L，pH值為7的檸檬酸鈉溶液，121°C高壓蒸汽處理30min，5600轉(zhuǎn)離心20分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到三角瓶中，參與物質(zhì)用去離子水洗滌3遍，離心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用濃度為0.lmol/L的鹽酸溶液將pH值調(diào)節(jié)到2.1，冰浴60分鐘，溶液中產(chǎn)生大量沉淀;將溶液過(guò)濾，濾液為EE-DOC，濾液收集到10ml容量瓶中定容;濾紙上的固態(tài)物質(zhì)便是EE-GRSP，再用0.1moI/L的氫氧化鈉溶液將其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;將容量瓶中的EE-DOC溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干；由于EE-DOC溶解在檸檬酸鈉溶液中，檸檬酸鈉的碳含量高，直接測(cè)定碳含量對(duì)試劑的需求量太大，因此，需要定容后從中量取20ml以備測(cè)定碳含量；
[0016]f.難提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白HE-GRSP和檸檬酸鈉難提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)HE-D0C的提取:上述殘余土中加入20ml濃度為0.05mol/L，pH值為8的檸檬酸鈉溶液，121°C高壓蒸汽處理90min，5600轉(zhuǎn)離心20分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到250ml三角瓶中，重新添加浸提液，混勻加熱，直到紅棕色很淡，一般重復(fù)5次熱抽提，個(gè)別含量很高的土壤需要增加次數(shù);殘余土用去離子水洗滌3遍，離心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用濃度為0.lmol/L的鹽酸溶液將PH值調(diào)節(jié)到2.1，冰浴60分鐘，溶液中產(chǎn)生大量沉淀;將溶液過(guò)濾，濾液是HE-DOC，濾液收集到10ml容量瓶中定容；濾紙上的固態(tài)物質(zhì)便是難提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白，再用0.lmol/L的氫氧化鈉溶液將其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;將容量瓶中的溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干；
[0017]g.殘余態(tài)有機(jī)組分Residual和結(jié)合態(tài)黑炭B-BC的提取:將上述殘余土風(fēng)干品均分成兩份，其中一份用于殘余態(tài)有機(jī)組分的測(cè)定;另一份轉(zhuǎn)入離心管中，加入6ml濃度為3moI/L的鹽酸溶液，室溫下反應(yīng)24小時(shí)，除去碳酸鹽，5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，倒掉上清液;加入6ml濃度為lOmol/L的氫氟酸，室溫下反應(yīng)24小時(shí)，除去硅酸鹽;5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，倒掉上清液；加入6ml濃度為10mol/L的鹽酸溶液，室溫下反應(yīng)24小時(shí)，除去可能生成的氟化鈣，5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，倒掉上清液;剩余樣品轉(zhuǎn)入50ml三角瓶中，加入6ml重鉻酸鉀和硫酸的混合液其中重絡(luò)酸鉀的濃度為0.lmol/L,硫酸的濃度為2mol/L，在溫度為55± TC的條件下反應(yīng)60小時(shí)，用去離子水沖洗轉(zhuǎn)入離心管中，5000轉(zhuǎn)離心20分鐘，棄去上清液，用去離子水清洗3次，剩余物質(zhì)就是B-BC;將黑炭樣品用去離子水沖洗轉(zhuǎn)入10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干；
[0018]四、步驟三提取出的有機(jī)組分碳含量的測(cè)定；
[0019]五、步驟三提取出的有機(jī)組分碳含量的計(jì)算。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:通過(guò)對(duì)同一土壤樣品按照一定順序行連續(xù)提取，對(duì)每種提取方式獲得的有機(jī)質(zhì)樣品分別進(jìn)行處理，獲得多個(gè)理化性質(zhì)不同的土壤有機(jī)組分樣品。本發(fā)明的將同一個(gè)土壤樣品中一系列的有機(jī)組分連續(xù)分提取，各組分之間不存在重疊。本發(fā)明采用的提取順序中，胡敏酸與富啡酸在球囊霉相關(guān)蛋白之前提取，避免了提取球囊霉素相關(guān)蛋白時(shí)，在高溫、偏堿性的環(huán)境中將大量胡敏酸和富啡酸提取出來(lái)，造成胡敏酸和球囊霉素相關(guān)蛋白之間的大量的重疊。本發(fā)明采用多步連續(xù)提取的方法提取有機(jī)組分，使得有機(jī)組分的提取率遠(yuǎn)高于單獨(dú)提取各種有機(jī)組分的提取率。
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1是本發(fā)明的提取流程圖。
[0022]圖2是本發(fā)明連續(xù)提取法與傳統(tǒng)提取法提取有機(jī)組份之一的對(duì)照表。
[0023]圖3是本發(fā)明連續(xù)提取法與傳統(tǒng)提取法提取有機(jī)組份之二的對(duì)照表。
[0024]圖4是本發(fā)明連續(xù)提取法與傳統(tǒng)提取法提取效率的對(duì)照表。
【具體實(shí)施方式】
[0025]現(xiàn)給合具體實(shí)施倒對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0026]本發(fā)明所述的土壤中不同有機(jī)組分的連續(xù)提取方法的連續(xù)提取步驟為:
[0027]一、土壤樣品的采集與預(yù)處理:
[0028]采樣地點(diǎn):采樣點(diǎn)1-天然次生林(記為N;經(jīng)瑋度:109°11.873’E 19。5.618，N;海拔:1145m);采樣點(diǎn)點(diǎn)2-—代橡膠林(記為FG;經(jīng)瑋度:109° 3.587‘E 19° 8.784 ’ N;海拔:133m);采樣點(diǎn)3-二代橡膠林(記為SG;經(jīng)瑋度:109° 24.275E 19° 28.555’N;海拔 125M)。
[0029]樣品采集0-20cm土層(記為a層)和20-40cm土層(記為b層)；每個(gè)采樣點(diǎn)采集3個(gè)重復(fù)。樣品編號(hào)記為:N-1-a，N_2_a ； N_3_a ； N_l_b ； N_2_b ； N_3_b ； FG-1-a ； FG-2—a ； FG-3—a ； FG-
1-b ； FG-2-b ;FG-3-b ； SG-1-a ； SG_2_a ； SG_3_a ； SG_l_b ； SG_2_b ； SG_3_b。編號(hào)說(shuō)明:例如N-1-a表示天然次生林-第一個(gè)采樣點(diǎn)-20_40cm 土層。
[0030]采集的土壤樣品風(fēng)干后過(guò)0.25mm篩。
[0031]二、試劑的配制:
[0032]所述的試劑的配制方法為:
[0033](I)碘化鈉溶液，密度為1.7g/cm3:將1200g碘化鈉溶于水中，用IL的容量瓶定容；
[0034](2)氯化鈣溶液，濃度為0.01mol/L;
[0035](3)焦磷酸鈉和氫氧化鈉混合液:焦磷酸鈉和氫氧化鈉的濃度均為0.lmol/L;
[0036](4)硫酸溶液，濃度約為3mo 1/L:量取163ml濃硫酸定容到IL;
[0037](5)硫酸溶液，濃度為0.02mo 1/L:吸取將溶液(4)66.7ml，定容到IL;
[0038](6)氫氧化鈉溶液，濃度為0.02mol/L；
[0039 ] (7)檸檬酸鈉溶液，濃度為0.02mo 1/L，pH值為7;
[0040](8)檸檬酸鈉溶液，濃度為0.05mol/L，pH值為8;
[0041 ] (9)鹽酸溶液，濃度為0.lmol/L:吸取8.33ml濃鹽酸，定容到IL;
[0042](10)鹽酸溶液，濃度為3mol/L:量取125ml濃鹽酸，定容到500ml;
[0043](11)氫氟酸溶液，濃度為1mo 1/L:用塑料量筒量取150ml純氫氟酸，用500ml塑料容量瓶定容；
[0044](12)鹽酸溶液，濃度為10mol/L:量取417ml濃鹽酸，定容到500ml;
[0045](13)重鉻酸鉀和硫酸的混合液:重鉻酸鉀濃度為0.lmol/L，硫酸濃度為2mol/L;
[0046](14)重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液，l/6K2Cr207)=0.8mol/L:將重鉻酸鉀試劑在烘箱中，105°C條件下烘干3小時(shí)，取出后在干燥器中冷卻8小時(shí)，冷卻后稱取39.225g，在水中加熱溶解，冷卻后用水定容至1L;
[0047](15)硫酸亞鐵溶液，F(xiàn)eSO4,0.2mol/L: 56.0g硫酸亞鐵，F(xiàn)eSO4'7H20，化學(xué)純，溶于水，加入15ml濃硫酸，用水定容至IL;
[0048](16)鄰啡羅啉試劑:1.485g鄰啡羅啉試及0.695g硫酸亞鐵溶于10ml水，在棕色瓶中保存。
[0049]三、不同有機(jī)組分的連續(xù)提取；
[0050]所述不同有機(jī)組分的連續(xù)提取包括如下步驟:
[0051]a.游離態(tài)顆粒有機(jī)質(zhì)和游離態(tài)黑炭的混合物的提取:取土樣2.5克到50ml塑料離心管中，加入20ml密度為1.7g/cm3的碘化鈉溶液，振蕩I小時(shí)，5600轉(zhuǎn)離心20分;這種操作重復(fù)3次，直到懸浮液中沒(méi)有懸浮物質(zhì)為止;懸浮物質(zhì)在0.7um的濾紙下過(guò)濾，用真空栗抽干，先用70ml左右0.0lmoVL的氯化鈣沖洗，再用去離子水洗直到電導(dǎo)率<50yS/cm;樣品轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中，離心管中殘余土保留以便下一步提??；測(cè)定提取物碳含量時(shí)應(yīng)把轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干；
[0052]b.閉蓄態(tài)顆粒有機(jī)質(zhì)和閉蓄態(tài)黑炭的混合物的提取:將上一步提取的殘余土，加入20ml密度為1.7g/cm3的碘化鈉溶液，用450 J/ml的超聲波處理I小時(shí)，溫度控制在40 °C以下，5600轉(zhuǎn)離心20分；這種操作重復(fù)3次，直到懸浮液中沒(méi)有懸浮物質(zhì)為止；懸浮物質(zhì)在0.7um的濾紙下過(guò)濾，用真空栗抽干，先用70ml左右0.01mol/L的氯化鈣沖洗，再用去離子水洗直到電導(dǎo)率〈50yS/cm;樣品轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中，離心管中殘余土用去離子水洗洗滌，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，此操作重復(fù)3次，保留以便下一步提取;測(cè)定提取物碳含量時(shí)應(yīng)把轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干；
[0053]c.顆粒態(tài)黑炭POM-BC的提取:將步驟a和步驟b得到的混合物合并，加入6ml重鉻酸鉀和硫酸的混合液，其中重絡(luò)酸鉀的濃度為0.lmol/L，硫酸的濃度為2mol/L，在溫度為55土
I°C的條件下反應(yīng)60小時(shí)，用去離子水沖洗轉(zhuǎn)入離心管中，5000轉(zhuǎn)離心20分鐘，棄去上清液，用去離子水清洗3次，剩余物質(zhì)就是P0M-BC;測(cè)定提取物碳含量時(shí)應(yīng)把轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干；
[0054]d.胡敏酸HA和富啡酸FA的提取:在步驟b的殘余土中加入0.lmol/L的焦磷酸鈉和
0.lmol/L的氫氧化鈉混合液20ml，通入氮?dú)?分鐘，震蕩12小時(shí);4500轉(zhuǎn)離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)入10ml容量瓶中，這一步驟重復(fù)3-5次，直到上清液無(wú)色為止，定容，此時(shí)容量瓶中收集的物質(zhì)為腐殖酸:胡敏酸和富啡酸;吸取濾液40ml于燒杯中，置于沸水浴上加熱，在玻璃棒攪拌下滴加3mol/L的硫酸溶液酸化，直至有絮狀沉淀為止，繼續(xù)加熱10分鐘使胡敏酸完全沉淀；以0.02mol/L的硫酸溶液洗滌濾紙和沉淀，洗至濾液無(wú)色為止，濾液為富啡酸，用150ml三角瓶收集；以熱的0.02mol/L氫氧化鈉溶液溶解沉淀，溶解液收集于150ml三角瓶中，如前法酸化;胡敏酸和富啡酸溶液60°C條件下水浴蒸干，以便下一步測(cè)定碳含量;離心管中殘余土用去離子水洗洗滌，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，此操作重復(fù)3次，保留以便下一步提?。?br>[0055]e.易提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白EE-GRSP和檸檬酸鈉易提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)EE-DOC的提取:上述殘余土中加入20ml濃度為0.02mol/L，pH值為7的檸檬酸鈉溶液，121°C高壓蒸汽處理30min，5600轉(zhuǎn)離心20分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到三角瓶中，參與物質(zhì)用去離子水洗滌3遍，離心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用濃度為0.lmol/L的鹽酸溶液將pH值調(diào)節(jié)到2.1，冰浴60分鐘，溶液中產(chǎn)生大量沉淀;將溶液過(guò)濾，濾液為EE-DOC，濾液收集到10ml容量瓶中定容;濾紙上的固態(tài)物質(zhì)便是EE-GRSP，再用0.1moI/L的氫氧化鈉溶液將其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;將容量瓶中的EE-DOC溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干；由于EE-DOC溶解在檸檬酸鈉溶液中，檸檬酸鈉的碳含量高，直接測(cè)定碳含量對(duì)試劑的需求量太大，因此，需要定容后從中量取20ml以備測(cè)定碳含量；
[0056]f.難提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白HE-GRSP和檸檬酸鈉難提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)HE-D0C的提取:上述殘余土中加入20ml濃度為0.05mol/L，pH值為8的檸檬酸鈉溶液，121°C高壓蒸汽處理90min，5600轉(zhuǎn)離心20分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到250ml三角瓶中，重新添加浸提液，混勻加熱，直到紅棕色很淡，一般重復(fù)5次熱抽提，個(gè)別含量很高的土壤需要增加次數(shù);殘余土用去離子水洗滌3遍，離心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用濃度為0.lmol/L的鹽酸溶液將PH值調(diào)節(jié)到2.1，冰浴60分鐘，溶液中產(chǎn)生大量沉淀;將溶液過(guò)濾，濾液是HE-DOC，濾液收集到10ml容量瓶中定容；濾紙上的固態(tài)物質(zhì)便是難提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白，再用
0.lmol/L的氫氧化鈉溶液將其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;將容量瓶中的溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干；
[0057]g.殘余態(tài)有機(jī)組分Residual和結(jié)合態(tài)黑炭B-BC的提取:將上述殘余土風(fēng)干品均分成兩份，其中一份用于殘余態(tài)有機(jī)組分的測(cè)定;另一份轉(zhuǎn)入離心管中，加入6ml濃度為3moI/L的鹽酸溶液，室溫下反應(yīng)24小時(shí)，除去碳酸鹽，5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，倒掉上清液;加入6ml濃度為lOmol/L的氫氟酸，室溫下反應(yīng)24小時(shí)，除去硅酸鹽;5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，倒掉上清液；加入6ml濃度為10mol/L的鹽酸溶液，室溫下反應(yīng)24小時(shí)，除去可能生成的氟化鈣，5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，倒掉上清液;剩余樣品轉(zhuǎn)入50ml三角瓶中，加入6ml重鉻酸鉀和硫酸的混合液其中重絡(luò)酸鉀的濃度為0.lmol/L,硫酸的濃度為2mol/L，在溫度為55± TC的條件下反應(yīng)60小時(shí)，用去離子水沖洗轉(zhuǎn)入離心管中，5000轉(zhuǎn)離心20分鐘，棄去上清液，用去離子水清洗3次，剩余物質(zhì)就是B-BC;
[0058]將黑炭樣品用去離子水沖洗轉(zhuǎn)入10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干。
[0059]本發(fā)明所述各有機(jī)組分碳含量的測(cè)定方法如下:步驟&、13、(3、(1、64^中的各組份在水浴蒸至近干的三角瓶中，分別加入5ml的重鉻酸鉀溶液和5ml的濃硫酸搖勻，瓶口放置彎頸漏斗，放于190-200°C的油浴上加熱，使三角瓶中溶液微沸，彎頸漏斗下端落下第一滴冷凝液開始計(jì)時(shí)，消煮5分鐘；取下三角瓶冷卻片刻，用去離子水洗冷凝器內(nèi)壁以及下端外壁，洗滌液收集于原三角瓶中；加入2-3滴鄰菲羅啉指示劑，用硫酸亞鐵滴定剩余的重鉻酸鉀，溶液顏色由橙黃—綠—棕色為止，即為終點(diǎn)；如果樣品滴定所用硫酸亞鐵的毫升數(shù)達(dá)不到空白標(biāo)定所用的硫酸亞鐵毫升數(shù)的1/3時(shí)，則應(yīng)增加重鉻酸鉀溶液與硫酸的體積，兩種溶液的體積比為I: 1.每批樣品分析時(shí)必須做兩個(gè)空白，取0.5g粉末狀二氧化硅代替有機(jī)組分，其它步驟與測(cè)定有機(jī)組分相同；測(cè)定結(jié)果取平均值。
[0060]四、本發(fā)明各有機(jī)組分碳含量的計(jì)算如下:
[0061 ] C= ((c*Vi/Vo)*(Vo-V)*M*10—3*1.l*100/m)*(V2/V3)
[0062]式中:C一一重鉻酸鉀法測(cè)得的碳含量；
[0063 ] C一一重鉻酸鉀(I /6K2Cr207)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位:mo I /L;
[0064]Vi一一加入重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位:ml;
[0065]Vo 空白標(biāo)定用去硫酸亞鐵的體積，單位:ml ；
[00??] V 滴定土樣用去硫酸亞鐵溶液體積，單位:ml ；
[0067]V2一一腐殖酸、易提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)和難提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)定容體積，單位:ml ；
[0068]V3一一腐殖酸、易提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)和難提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)用于測(cè)定的體積，單位:ml ；
[0069]M——1/4C的摩爾質(zhì)量，M(1/4C) =3g/mol ；
[0070]10 3 將ml換算成L的系數(shù)；
[0071]1.1一一氧化校正系數(shù)；
[0072]關(guān)于計(jì)算EE-DOC和HE-DOC碳含量的說(shuō)明:計(jì)算檸檬酸鈉易提取態(tài)可溶性有機(jī)組分和檸檬酸鈉難提取態(tài)可溶性有機(jī)組分的碳含量是要注意去掉檸檬酸鈉的含碳量，在以上計(jì)算結(jié)果的基礎(chǔ)上，將含碳量帶入一下計(jì)算公式得到C.即為檸檬酸鈉提取可溶性有機(jī)質(zhì)的含量；
[0073]Cdqc= (C-(20*Co*12*6*10—3) )*5/m
[0074]C一一重鉻酸鉀法測(cè)得的碳含量；
[0075]Cdoc一一檸檬酸鈉提取可溶性有機(jī)質(zhì)的含量；
[0076]V4 提取液的用量20ml;
[0077]Co——檸檬酸鈉的濃度，單位mol/L
[0078]本發(fā)明所述的顆粒態(tài)黑炭(POM-BC)屬于土壤黑炭，分離出來(lái)的顆粒有機(jī)質(zhì)經(jīng)過(guò)低濃度重鉻酸鉀和濃硫酸的混合液的處理剩余的組分就是顆粒態(tài)黑炭。這部分黑炭由于自身密度小，在提取土壤顆粒有機(jī)質(zhì)時(shí)被同時(shí)提出。因此，從提取方法的角度定義，顆粒態(tài)黑炭也是土壤顆粒有機(jī)質(zhì)的一部分。由于以往的研究沒(méi)有認(rèn)識(shí)到顆粒態(tài)黑炭的存在，在顆粒態(tài)有機(jī)質(zhì)測(cè)定時(shí)沒(méi)有考慮這部分黑炭。實(shí)際上顆粒態(tài)黑炭可以占黑炭總量的很大一部分。
[OO79 ]本發(fā)明所述的結(jié)合態(tài)黑炭(B-BC)是和土壤中礦物質(zhì)結(jié)合的土壤黑炭；
[0080]本發(fā)明所述的黑碳總量是土壤顆粒態(tài)黑炭加上結(jié)合態(tài)黑炭的和。
[0081]本發(fā)明所述的難提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白(HE-GRSP)是在提取易提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白(EE-GRSP)之后，改變提取條件后進(jìn)一步提取出來(lái)的球囊霉素相關(guān)蛋白；
[0082]本發(fā)明所述的檸檬酸鈉易提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)(EE-DOC)是在提取易提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白(HE-GRSP)的過(guò)程中，伴隨提出了一部分有機(jī)組分，這種有機(jī)組分在酸性條件下不會(huì)發(fā)生沉淀，把這部分有機(jī)組分命名為檸檬酸鈉易提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)(EE-DOC)。在提取易提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白(HE-GRSP)的過(guò)程中，將檸檬酸鈉提取液進(jìn)行酸化出現(xiàn)沉淀后，溶液仍然帶有較深的顏色，將這部分物質(zhì)通過(guò)重鉻酸鉀氧化法測(cè)定有機(jī)質(zhì)含量，所得結(jié)果減去檸檬酸鈉碳含量之后發(fā)現(xiàn)，仍然剩余一部分碳的量，這表明提取土壤EE-DOC的過(guò)程中伴隨提出了一部分有機(jī)組分，這種有機(jī)組分在酸性條件下不會(huì)發(fā)生沉淀，把這部分有機(jī)組分命名為檸檬酸鈉易提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)(EE-DOC)。
[0083]本發(fā)明所述的檸檬酸鈉難提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)(HE-DOC):在提取難提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白(HE-GRSP)的過(guò)程中，伴隨提出了一部分有機(jī)組分，這種有機(jī)組分在酸性條件下不會(huì)發(fā)生沉淀，把這部分有機(jī)組分命名為檸檬酸鈉難提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)(EE-D0C)。在提取難提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白(HE-GRSP)的過(guò)程中，將檸檬酸鈉提取液進(jìn)行酸化出現(xiàn)沉淀后，溶液仍然帶有較深的顏色，將這部分物質(zhì)通過(guò)重鉻酸鉀氧化法測(cè)定有機(jī)質(zhì)含量，所得結(jié)果減去檸檬酸鈉碳含量之后發(fā)現(xiàn)，仍然剩余一部分碳的量，這表明提取土壤EE-DOC的過(guò)程中伴隨提出了一部分有機(jī)組分，這種有機(jī)組分在酸性條件下不會(huì)發(fā)生沉淀，把這部分有機(jī)組分命名為檸檬酸鈉難提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)(EE-DOC)。
[0084]上述本發(fā)明在傳統(tǒng)的有機(jī)質(zhì)分類中將提取球囊霉素相關(guān)蛋白時(shí)檸檬酸鈉提取液中未發(fā)生沉淀的物質(zhì)也納為土壤有機(jī)質(zhì)的一個(gè)組分，暫命名為檸檬酸鈉可提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)。
[0085]本發(fā)明所述的顆粒有機(jī)質(zhì)(POM)主要是來(lái)自于動(dòng)植物殘?bào)w的半分解產(chǎn)物，是沒(méi)有與土壤礦質(zhì)土粒以化學(xué)鍵緊密結(jié)合在一起的不穩(wěn)定土壤有機(jī)質(zhì)。
[0086]本發(fā)明所述的顆粒有機(jī)質(zhì)是傳統(tǒng)方法提取得到的顆粒有機(jī)質(zhì)去掉黑炭后的部分。傳統(tǒng)方法提取得到的顆粒有機(jī)質(zhì)中分離出了黑炭，而從顆粒有機(jī)質(zhì)的組成成分的定義來(lái)講，不包括黑炭，傳統(tǒng)顆粒有機(jī)質(zhì)提取法得到的物質(zhì)叫做顆粒態(tài)有機(jī)質(zhì)和顆粒態(tài)黑炭的混合物。
[0087]本發(fā)明所述的土壤黑炭包括顆粒態(tài)黑炭和結(jié)合態(tài)黑炭?jī)刹糠?。從傳統(tǒng)的定義認(rèn)為，土壤黑炭是化石燃料和生物質(zhì)不完全燃燒產(chǎn)生的富含碳元素的有機(jī)連續(xù)統(tǒng)一體，包括從輕度碳化的易分解的生物質(zhì)到高度抗芳香化的抗分解石墨碳和煙塵顆粒等。近期人為活動(dòng)產(chǎn)生的黑炭密度較輕，隨顆粒有機(jī)質(zhì)提取出來(lái)，為顆粒態(tài)黑炭;早期地質(zhì)年代自然產(chǎn)生的黑炭，在自然條件下與土壤礦物質(zhì)長(zhǎng)期相互作用，形成結(jié)合態(tài)黑炭。
[0088]關(guān)于計(jì)算顆粒態(tài)有機(jī)質(zhì)碳含量的說(shuō)明:
[0089]本發(fā)明中的顆粒態(tài)有機(jī)質(zhì)(POM)是指?jìng)鹘y(tǒng)方法提取得到的顆粒有機(jī)質(zhì)(即本發(fā)明中的顆粒有機(jī)質(zhì)和顆粒態(tài)黑炭的混合物)去掉黑炭所剩的部分。因此，POM的碳含量是用本發(fā)明中顆粒有機(jī)質(zhì)和顆粒態(tài)黑炭的混合物的碳含量減去顆粒態(tài)黑炭的碳含量而得到的值。
[0090]關(guān)于計(jì)算土壤總的黑炭碳含量的說(shuō)明:
[0091]土壤黑炭是由顆粒態(tài)黑炭和結(jié)合態(tài)黑炭?jī)刹糠纸M成的。因此土壤中總的黑炭的碳含量是顆粒態(tài)黑炭和結(jié)合態(tài)黑炭碳含量相加的和。
[0092]利用傳統(tǒng)方法對(duì)土壤有機(jī)組分進(jìn)行提取:
[0093]樣品采集與預(yù)處理、溶液配制以及各組分有機(jī)質(zhì)含碳量測(cè)定與本發(fā)明的相關(guān)操作相同，不同之處在于直接對(duì)稱量好的土樣進(jìn)行提取，而不是按照一定順序進(jìn)行連續(xù)提取。
[0094]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
[0095]圖2是連續(xù)提取法與傳統(tǒng)提取法對(duì)照表。胡敏酸與富啡酸、顆粒有機(jī)質(zhì)與黑炭的提取結(jié)果。連續(xù)提取方法與傳統(tǒng)方法相比，胡敏酸、富啡酸與顆粒有機(jī)質(zhì)之間的碳含量沒(méi)有差異。連續(xù)提取法顆粒有機(jī)質(zhì)與殘余組分中均提出了黑炭，兩部分碳含量之和與傳統(tǒng)方法之間差異不大。
[0096]圖3是連續(xù)提取法與傳統(tǒng)提取法易提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白、檸檬酸鈉易提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)、難提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白、難溶性檸檬酸鈉可溶性有機(jī)質(zhì)提取結(jié)果對(duì)照表。連續(xù)提取與傳統(tǒng)提取方法相比，以上4種有機(jī)組分的碳含量均小于傳統(tǒng)方法，這說(shuō)明傳統(tǒng)方法利用檸檬酸鈉溶液提取到的土壤有機(jī)組分和胡敏酸、富啡酸之間存在重疊、連續(xù)提取的方法解決了不同有機(jī)組分之間重疊的問(wèn)題。
[0097]圖4是有機(jī)組分提取率對(duì)照表。連續(xù)提取試驗(yàn)中將顆粒有機(jī)質(zhì)、胡敏酸、富啡酸、易提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白、檸檬酸鈉易提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)、難提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白、難溶性檸檬酸鈉可溶性有機(jī)質(zhì)之和除以土壤有機(jī)質(zhì)總量計(jì)算其有機(jī)組分提取率。傳統(tǒng)提取方式中，選取提取量最大的組分除以土壤有機(jī)質(zhì)總量記為最大提取率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)提取中有機(jī)組分的提取率大于傳統(tǒng)方法的最大提取率，說(shuō)明連續(xù)提取的方法能夠更加充分的將土壤有機(jī)組分提取出來(lái)。
[0098]連續(xù)提取試驗(yàn)中將顆粒有機(jī)質(zhì)、胡敏酸、富啡酸、易提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白、檸檬酸鈉易提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)、難提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白、難溶性檸檬酸鈉可溶性有機(jī)質(zhì)、殘余態(tài)有機(jī)組分之和除以土壤有機(jī)質(zhì)總量計(jì)算回收率。樣品的平均回收率為109.05±3.29%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種土壤中不同有機(jī)組分的連續(xù)提取方法，其特征在于所述的連續(xù)提取步驟如下: 一、土壤樣品的采集與預(yù)處理； 二、試劑的配制； 三、不同有機(jī)組分的連續(xù)提?。?所述不同有機(jī)組分的連續(xù)提取包括如下步驟: a.游離態(tài)顆粒有機(jī)質(zhì)和游離態(tài)黑炭的混合物的提取:取土樣2.5克到50ml塑料離心管中，加入20ml密度為1.7g/cm3的碘化鈉溶液，振蕩I小時(shí)，5600轉(zhuǎn)離心20分;這種操作重復(fù)3次，直到懸浮液中沒(méi)有懸浮物質(zhì)為止;懸浮物質(zhì)在0.7um的濾紙下過(guò)濾，用真空栗抽干，先用70ml左右0.0lmol/L的氯化鈣沖洗，再用去離子水洗直到電導(dǎo)率〈50yS/cm;樣品轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中，離心管中殘余土保留以便下一步提取；測(cè)定提取物碳含量時(shí)應(yīng)把轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干； b.閉蓄態(tài)顆粒有機(jī)質(zhì)和閉蓄態(tài)黑炭的混合物的提取:將上一步提取的殘余土，加入20ml密度為1.7g/cm3的碘化鈉溶液，用450J/ml的超聲波處理I小時(shí)，溫度控制在40°C以下，5600轉(zhuǎn)離心20分;這種操作重復(fù)3次，直到懸浮液中沒(méi)有懸浮物質(zhì)為止;懸浮物質(zhì)在0.7um的濾紙下過(guò)濾，用真空栗抽干，先用70ml左右0.01mol/L的氯化鈣沖洗，再用去離子水洗直到電導(dǎo)率〈50yS/cm;樣品轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中，離心管中殘余土用去離子水洗洗滌，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，此操作重復(fù)3次，保留以便下一步提取;測(cè)定提取物碳含量時(shí)應(yīng)把轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干； c.顆粒態(tài)黑炭POM-BC的提取:將步驟a和步驟b得到的混合物合并，加入6ml重鉻酸鉀和硫酸的混合液，其中重鉻酸鉀的濃度為0.1mo I/L，硫酸的濃度為2mo I/L，在溫度為55 土 1°C的條件下反應(yīng)60小時(shí)，用去離子水沖洗轉(zhuǎn)入離心管中，5000轉(zhuǎn)離心20分鐘，棄去上清液，用去離子水清洗3次，剩余物質(zhì)就是POM-BC;測(cè)定提取物碳含量時(shí)應(yīng)把轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中的樣品，在60°C條件下水浴蒸干； d.胡敏酸HA和富啡酸FA的提取:在步驟b的殘余土中加入0.1mo I/L的焦磷酸鈉和0.lmol/L的氫氧化鈉混合液20ml，通入氮?dú)?分鐘，震蕩12小時(shí);4500轉(zhuǎn)離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)入10ml容量瓶中，這一步驟重復(fù)3-5次，直到上清液無(wú)色為止，定容，此時(shí)容量瓶中收集的物質(zhì)為腐殖酸:胡敏酸和富啡酸;吸取濾液40ml于燒杯中，置于沸水浴上加熱，在玻璃棒攪拌下滴加3mol/L的硫酸溶液酸化，直至有絮狀沉淀為止，繼續(xù)加熱10分鐘使胡敏酸完全沉淀；以0.02mol/L的硫酸溶液洗滌濾紙和沉淀，洗至濾液無(wú)色為止，濾液為富啡酸，用150ml三角瓶收集；以熱的0.02mol/L氫氧化鈉溶液溶解沉淀，溶解液收集于150ml三角瓶中，如前法酸化;胡敏酸和富啡酸溶液60°C條件下水浴蒸干，以便下一步測(cè)定碳含量;離心管中殘余土用去離子水洗洗滌，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，此操作重復(fù)3次，保留以便下一步提取； e.易提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白EE-GRSP和檸檬酸鈉易提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)EE-DOC的提取:上述殘余土中加入20ml濃度為0.02mol/L，pH值為7的檸檬酸鈉溶液，121°C高壓蒸汽處理30min，5600轉(zhuǎn)離心20分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到三角瓶中，參與物質(zhì)用去離子水洗滌3遍，離心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用濃度為0.lmol/L的鹽酸溶液將pH值調(diào)節(jié)到2.1，冰浴60分鐘，溶液中產(chǎn)生大量沉淀;將溶液過(guò)濾，濾液為EE-DOC，濾液收集到I OOml容量瓶中定容;濾紙上的固態(tài)物質(zhì)便是EE-GRSP，再用0.1moVL的氫氧化鈉溶液將其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;將容量瓶中的EE-DOC溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干；由于EE-DOC溶解在檸檬酸鈉溶液中，檸檬酸鈉的碳含量高，直接測(cè)定碳含量對(duì)試劑的需求量太大，因此，需要定容后從中量取20ml以備測(cè)定碳含量； f.難提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白HE-GRSP和檸檬酸鈉難提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)HE-DOC的提取:上述殘余土中加入20ml濃度為0.05mol/L，pH值為8的檸檬酸鈉溶液，121°C高壓蒸汽處理90min，5600轉(zhuǎn)離心20分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到250ml三角瓶中，重新添加浸提液，混勻加熱，直到紅棕色很淡，一般重復(fù)5次熱抽提，個(gè)別含量很高的土壤需要增加次數(shù);殘余土用去離子水洗滌3遍，離心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用濃度為0.lmol/L的鹽酸溶液將pH值調(diào)節(jié)到2.1，冰浴60分鐘，溶液中產(chǎn)生大量沉淀;將溶液過(guò)濾，濾液是HE-DOC，濾液收集到10ml容量瓶中定容；濾紙上的固態(tài)物質(zhì)便是難提取態(tài)球囊霉素相關(guān)蛋白，再用0.lmol/L的氫氧化鈉溶液將其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;將容量瓶中的溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干； g.殘余態(tài)有機(jī)組分Residual和結(jié)合態(tài)黑炭B-BC的提取:將上述殘余土風(fēng)干品均分成兩份，其中一份用于殘余態(tài)有機(jī)組分的測(cè)定；另一份轉(zhuǎn)入離心管中，加入6ml濃度為3mol/L的鹽酸溶液，室溫下反應(yīng)24小時(shí)，除去碳酸鹽，5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，倒掉上清液;加入6ml濃度為lOmol/L的氫氟酸，室溫下反應(yīng)24小時(shí)，除去硅酸鹽;5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，倒掉上清液;加入6ml濃度為lOmol/L的鹽酸溶液，室溫下反應(yīng)24小時(shí)，除去可能生成的氟化鈣，5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，倒掉上清液;剩余樣品轉(zhuǎn)入50ml三角瓶中，加入6ml重鉻酸鉀和硫酸的混合液其中重絡(luò)酸鉀的濃度為0.lmol/L,硫酸的濃度為2mol/L，在溫度為55± TC的條件下反應(yīng)60小時(shí)，用去離子水沖洗轉(zhuǎn)入離心管中，5000轉(zhuǎn)離心20分鐘，棄去上清液，用去離子水清洗3次，剩余物質(zhì)就是B-BC;將黑炭樣品用去離子水沖洗轉(zhuǎn)入10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干； 四、步驟三提取出的有機(jī)組分碳含量的測(cè)定； 五、步驟三提取出的有機(jī)組分碳含量的計(jì)算。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤中不同有機(jī)組分的連續(xù)提取方法，其特征在于所述的步驟四中有機(jī)組分碳含量的測(cè)定方法如下:步驟a、b、c、d、e、f、g中的各組份在水浴蒸至近干的三角瓶中，分別加入5 m I的重鉻酸鉀溶液和5 m I的濃硫酸搖勻，瓶口放置彎頸漏斗，放于190-200°C的油浴上加熱，使三角瓶中溶液微沸，彎頸漏斗下端落下第一滴冷凝液開始計(jì)時(shí)，消煮5分鐘;取下三角瓶冷卻片刻，用去離子水洗冷凝器內(nèi)壁以及下端外壁，洗滌液收集于原三角瓶中；加入2-3滴鄰菲羅啉指示劑，用硫酸亞鐵滴定剩余的重鉻酸鉀，溶液顏色由橙黃—綠—棕色為止，即為終點(diǎn)；如果樣品滴定所用硫酸亞鐵的毫升數(shù)達(dá)不到空白標(biāo)定所用的硫酸亞鐵毫升數(shù)的1/3時(shí)，則應(yīng)增加重鉻酸鉀溶液與硫酸的體積，兩種溶液的體積比為I: 1.每批樣品分析時(shí)必須做兩個(gè)空白，取0.5g粉末狀二氧化硅代替有機(jī)組分，其它步驟與測(cè)定有機(jī)組分相同；測(cè)定結(jié)果取平均值。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤中不同有機(jī)組分的連續(xù)提取方法，其特征在于所述的步驟五有機(jī)組分碳含量的計(jì)算如下: C= ((c*Vi/Vo)*(Vo_V)*M*10—3*1.l*100/m)*(V2/V3) 式中:C一一重鉻酸鉀法測(cè)得的碳含量； C——重鉻酸鉀(l/6K2Cr207)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位:mol/L; Vi一一加入重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位:ml; Vo 空白標(biāo)定用去硫酸亞鐵的體積，單位:ml ； V 滴定土樣用去硫酸亞鐵溶液體積，單位:ml ； V2—一腐殖酸、易提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)和難提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)定容體積，單位:ml; V3—一腐殖酸、易提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)和難提取態(tài)可溶性有機(jī)質(zhì)用于測(cè)定的體積，單位:ml ； M——1/4C的摩爾質(zhì)量，M( 1/4C) = 3g/mol ； 10 3 將ml換算成L的系數(shù)； I.I—氧化校正系數(shù)； 關(guān)于計(jì)算EE-DOC和HE-DOC碳含量的說(shuō)明:計(jì)算檸檬酸鈉易提取態(tài)可溶性有機(jī)組分和檸檬酸鈉難提取態(tài)可溶性有機(jī)組分的碳含量是要注意去掉檸檬酸鈉的含碳量，在以上計(jì)算結(jié)果的基礎(chǔ)上，將含碳量帶入一下計(jì)算公式得到Cdqc即為檸檬酸鈉提取可溶性有機(jī)質(zhì)的含量；Cdoc= (C_(20*Co*12*6*10—3) )*5/mC一一重鉻酸鉀法測(cè)得的碳含量； Cdoc--朽1檬酸鈉提取可溶性有機(jī)質(zhì)的含量； V4 提取液的用量20ml ； Co——檸檬酸鈉的濃度，單位mol/L。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤中不同有機(jī)組分的連續(xù)提取方法，其特征在于所述的步驟一土壤樣品的采集與預(yù)處理方法為:土壤樣品風(fēng)干后過(guò)0.25mm篩，備用。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤中不同有機(jī)組分的連續(xù)提取方法，其特征在于所述的步驟二中的試劑配制方法為: (1)碘化鈉溶液，密度為I.7g/cm3:將1200g碘化鈉溶于水中，用IL的容量瓶定容； (2)氯化媽溶液，濃度為0.0 lmol/L; (3)焦磷酸鈉和氫氧化鈉混合液:焦磷酸鈉和氫氧化鈉的濃度均為0.lmol/L; (4)硫酸溶液，濃度約為3mol/L:量取163ml濃硫酸定容到1L; (5)硫酸溶液，濃度為0.02mol/L:吸取將溶液(4)66.7ml，定容到IL; (6)氫氧化鈉溶液，濃度為0.02mol/L; (7)檸檬酸鈉溶液，濃度為0.02mol/L，pH值為7; (8)檸檬酸鈉溶液，濃度為0.05mol/L，pH值為8; (9)鹽酸溶液，濃度為0.lmol/L:吸取8.33ml濃鹽酸，定容到IL; (10)鹽酸溶液，濃度為3mol/L:量取125ml濃鹽酸，定容到500ml; (11)氫氟酸溶液，濃度為lOmol/L:用塑料量筒量取150ml純氫氟酸，用500ml塑料容量瓶定容； (12)鹽酸溶液，濃度為lOmol/L:量取417ml濃鹽酸，定容到500ml; (13)重絡(luò)酸鉀和硫酸的混合液:重絡(luò)酸鉀濃度為0.lmol/L，硫酸濃度為2mol/L; (14)重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液，l/6K2Cr207)=0.8mol/L:將重鉻酸鉀試劑在烘箱中，105°C條件下烘干3小時(shí)，取出后在干燥器中冷卻8小時(shí)，冷卻后稱取39.225g，在水中加熱溶解，冷卻后用水定容至1L; (15)硫酸亞鐵溶液，F(xiàn)eSO4，0.2mol/L: 56.0g硫酸亞鐵，F(xiàn)eSO4^H2O，化學(xué)純，溶于水，加入15ml濃硫酸，用水定容至IL; (16)鄰啡羅啉試劑:1.485g鄰啡羅啉試及0.695g硫酸亞鐵溶于10ml水，在棕色瓶中保 存。
【文檔編號(hào)】G01N21/79GK106093289SQ201610580157
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月22日 公開號(hào)201610580157.5, CN 106093289 A, CN 106093289A, CN 201610580157, CN-A-106093289, CN106093289 A, CN106093289A, CN201610580157, CN201610580157.5
【發(fā)明人】吳蔚東, 蘭天, 王海龍
【申請(qǐng)人】海南大學(xué)