固定化蛋白酶的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及固定化酶的制備方法及應用，具體涉及生產一種固定化蛋白酶的制備 方法及應用。
【背景技術】
[0002] 酶的固定化及其酶促反應是最具發(fā)展前景的生物技術前沿領域之一。固定化酶已 經廣泛應用于生物化學、生物技術與工程、生物醫(yī)學工程、化學化工等方面，將在人類社會 可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮重要作用。與游離酶相比，固定化酶具有穩(wěn)定性更好，分離回收容易，可 多次重復利用等優(yōu)點。根據固定化酶的制備方法，可通過包埋法、交聯(lián)法、吸附法和共價結 合法來實現酶的固定化。
[0003] 近年來，我國在固定化酶方面做了大量研究。2010年武漢工業(yè)學院提供了一種殼 聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法(201010103862.9)。該技術以殼聚糖為固定化載體，將殼 聚糖在醋酸溶液中溶解后，利用反相懸浮法制備殼聚糖微球，然后利用戊二醛為交聯(lián)劑對 殼聚糖微球進行交聯(lián)活化，將交聯(lián)活化后的殼聚糖微球與胰蛋白酶溶液混合進行固定化， 制得固定化胰蛋白酶。2011年杭州師范大學提供了一種嗜熱菌蛋白酶的固定化方法 (201110363336.0)，具體方法如下：（1)載體活化:將氨基化的介孔泡沫硅載體MCFS-NH2浸 漬在0.5~2.5mM的對苯醌溶液中，振蕩活化1~3小時，離心，取沉淀洗滌，洗滌后的沉淀重 新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的載體液；（2)酶的固定化:將活化的載體液，按40~ l〇〇mg嗜熱菌蛋白酶/g MCFS-NH2的加酶量，加入嗜熱菌蛋白酶得到混合液，將混合液在冰 浴中電磁攪拌反應18~20h或者在0~7°C、20~50W微波條件下照射2~4min，離心，取沉淀 用MES-NaOH溶液洗滌，得到固定化嗜熱菌蛋白酶;通過該發(fā)明方法制得的固定化嗜熱菌蛋 白酶在性能上比自由酶有了很大的提高，還大大地縮短了固定化時間，從20h縮短到了 3min，整整縮短了 399倍，這使得酶固定化的成本得到了降低。2012年信陽職業(yè)技術學院公 開了 一種基于膨化珍珠巖載體的固定化蛋白酶(201210267418. X)，該固定化蛋白酶由以下 制備方法制得:將蛋白酶溶解在液體介質中，得到蛋白酶溶液;再將膨化珍珠巖或者表面經 改性后的膨化珍珠巖與所述蛋白酶溶液均勻混合，并在20 °C-40 °C條件下處理3-6個小時， 以使所述蛋白酶溶液中的蛋白分子與膨化珍珠巖內部微孔內表面充分接觸;最后，以離心 或過濾的方法除去液體介質，進行干燥，即得到固定化蛋白酶。這一發(fā)明以膨化珍珠巖或者 經過表面改性后的膨化珍珠巖為載體材料，其具有穩(wěn)定性強和酶活性高的特點，與現有方 法制作得到的固定化蛋白酶相比，該固定化蛋白酶的活性達到80U/mg以上，提高了 25%左 右。20 14年浙江工商大學熊春華教授公開了一種固定化木瓜蛋白酶的方法 (201410265922.5)，包括以下步驟：1)將聚丙烯腈樹脂用反應溶劑浸泡溶脹后，加入氨基葡 萄糖鹽酸鹽和K2C03，在氮氣保護下進行反應;然后過濾;2)所得濾渣先用無水乙醇浸泡洗 滌，然后依次進行酸洗和水洗;接著真空干燥，得PAN-GA載體;3)在PAN-GA載體中加入Nal04 溶液避光氧化，洗滌后，再加入pH為6.5~8.5的磷酸緩沖液和木瓜蛋白酶進行固定化反應， 接著過濾分離;所得濾餅沖洗后干燥，得固定化木瓜蛋白酶。本發(fā)明所采用的用于固定化木 瓜蛋白酶的載體(PAN-GA)，能克服現有技術所合成的載體在酶固定化過程中，由于剛性碰 撞造成的酶活力損失。
[0004] 采用交聯(lián)法或共價結合法制備的固定化蛋白酶在制備過程中需要引入有毒、有害 試劑，如戊二醛、Nal04等，在食品制造過程中存在安全隱患。采用包埋法制備的固定化蛋白 酶在使用過程中存在固定化蛋白酶物理強度不夠，易破壞等難題。采用吸附法制備的固定 化蛋白酶在使用過程中蛋白酶損失較大，難以多次利用。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現有技術存在的上述不足，提供一種固定化蛋白酶的制備 方法及應用。
[0006] 本發(fā)明的目的至少通過如下技術方案之一實現。
[0007] 固定化蛋白酶的制備方法，該方法將雞骨粉碎至50-100目，與1-5倍質量的有機酸 溶液混合后，加熱至90-100°(：保持10-151^11，冷卻至5-35°(：后，添加蛋白酶后保溫3-611，過 濾去除上清液和油脂，得到固定化蛋白酶。
[0008] 進一步優(yōu)化地，所述有機酸溶液為琥珀酸、檸檬酸、乙酸溶液中任意一種。
[0009] 進一步優(yōu)化地，所述有機酸溶液中有機酸含量為1 〇%( g/ml)。
[0010] 進一步優(yōu)化地，所述蛋白酶的添加量為雞骨重量的10-20%。
[0011] 進一步優(yōu)化地，所述蛋白酶為木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶和復合蛋白酶 中任意一種或多種。
[0012] 進一步優(yōu)化地，所述保溫條件為:溫度10-20°C。
[0013] 進一步優(yōu)化地，固定化蛋白酶在水解食物蛋白質制備呈味基料及調味品中的應 用。
[0014] 進一步優(yōu)化地，固定化蛋白酶在水解雞胸肉制備雞肉粉中的應用。
[0015] 本發(fā)明與現有技術相比，具有如下優(yōu)點和技術效果： (1)本發(fā)明利用有機酸對雞骨進行處理得到的雞骨渣對蛋白酶具有較好的吸附和保留 能力，對蛋白酶的催化活性無影響。
[0016] (2)本發(fā)明在制備固定化蛋白酶過程中未引入任何非食品添加劑，不存在安全隱 患。本發(fā)明制備的固定化酶尤其適合于雞肉、雞骨架等生物資源的酶解。
【具體實施方式】
[0017] 以下結合實例對本發(fā)明的具體實施作進一步說明，但本發(fā)明的施舍保護不限于 此，其中若有未特別詳細說明之過程或工藝參數，均是本領域技術人員可參照現有技術實 現的。
[0018] 蛋白酶活力的測定：SB/T 10317-1999 固定化酶蛋白酶的酶活力回收率：商品酶制劑的總酶活/固定化蛋白酶的總酶活* 100%〇
[0019]固定化酶蛋白酶的評價:將雞胸肉磨碎后，添加雞胸肉重量5%的實施例制得的固 定化蛋白酶，50°C水解12h后，離心去除雞肉酶解液，清洗，回收固定化酶，作為使用1次。
[0020] 實施例1 將l〇〇g雞骨粉碎至50目，與1倍重量10%(g/ml)琥珀酸混溶液混合后，加熱至100°C保持 lOmin，冷卻至35°C后，添加10g堿性蛋白酶后保溫3h，過濾去除上清液和油脂，得到固定化 蛋白酶。固定化酶蛋白酶的酶活力回收率為80.4%。
[0021] 表1
由表1可見，固定化蛋白酶在使用3次以后仍保留著90.3%的活力；固定化蛋白酶在使用 7次以后仍保留著87 · 4%的活力。
[0022] 實施例2 將lkg雞骨粉碎至100目，與2倍10%(g/ml)檸檬酸溶液混合后，加熱至90°C保持15min， 冷卻至5°C后，添加20g風味蛋白酶后保溫6h，過濾去除上清液和油脂，得到固定化蛋白酶。 固定化蛋白酶的酶活力回收率為88.2%。
[0023]表 2
由表2可見，固定化蛋白酶在使用3次以后仍保留著89.9%的活力；固定化蛋白酶在使用 7次以后仍保留著83 · 9%的活力。
[0024] 實施例3 將3kg雞骨粉碎至80目，與5倍10%(g/ml)乙酸溶液混合后，加熱至95°C保持12min，冷卻 至15°C后，添加15g木瓜蛋白酶后保溫4h，過濾去除上清液和油脂，得到固定化蛋白酶。固定 化蛋白酶的酶活力回收率為82.9%。
[0025] 表 3
由表2可見，固定化蛋白酶在使用3次以后仍保留著89.9%的活力；固定化蛋白酶在使用 7次以后仍保留著80.2%的活力。
【主權項】
1. 固定化蛋白酶的制備方法，其特征在于:將雞骨粉碎至50-100目，與1-5倍質量的有 機酸溶液混合后，加熱至90-100 °C保持10-15min，冷卻至5-35 °C后，添加蛋白酶后保溫3-6h，過濾去除上清液和油脂，得到固定化蛋白酶。2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征是所述有機酸溶液為琥珀酸、檸檬酸、乙酸 溶液中任意一種。3. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征是所述有機酸溶液中有機酸含量為10%(g/ ml)〇4. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征是所述蛋白酶的添加量為雞骨重量的10-20% 〇5. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征是所述蛋白酶為木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、 風味蛋白酶和復合蛋白酶中任意一種或多種。6. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征是所述保溫條件為:溫度10-20°C。7. 權利要求1所述制備方法制得的固定化蛋白酶的應用，其特征是固定化蛋白酶在水 解食物蛋白質制備呈味基料及調味品中的應用。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于固定化蛋白酶在水解雞胸肉制備雞肉粉中 的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開固定化蛋白酶的制備方法及應用。所述制備方法將雞骨粉碎后，與0.1倍重量有機酸混合后，加熱至90-100℃保持10-15min，冷卻至25-35℃后，添加蛋白酶3-6h，過濾，得到固定化蛋白酶。本發(fā)明利用有機酸對雞骨進行處理得到的雞骨渣對蛋白酶具有較好的吸附和保留能力，對蛋白酶的催化活性無影響。本發(fā)明在制備固定化蛋白酶過程中未引入任何非食品添加劑，不存在安全隱患。本發(fā)明制備的固定化酶尤其適合于雞肉、雞骨架等生物資源的酶解。
【IPC分類】C12N11/02, A23L27/21
【公開號】CN105647899
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】陳穗, 楊明泉, 賈愛娟, 高聽明, 石慶安, 康嫣, 龔軒陽
【申請人】廣東廚邦食品有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月15日