實(shí)時熒光定量pcr對川貝母的鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供一種對川貝母的鑒別方法，具體的說，實(shí)時熒光定量PCR對川貝母的鑒 別方法;屬于化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 川貝母主要分布于四川、云南、西藏等地，品質(zhì)較優(yōu)，為百合科植物川貝母、棱砂、 烏花等的鱗莖，具有清熱潤肺、化痰止咳的功效，藥用價值較高。傳統(tǒng)的川貝母的鑒別，主要 是性狀、顯微鑒別、光譜法，由于市場上貝母類藥材品種較多，相同品種間也會因?yàn)樗幵粗?物來源不一、種植環(huán)境、產(chǎn)地和加工等因素存在相當(dāng)?shù)幕祀s度，這就使得實(shí)驗(yàn)人員必須具備 較高的藥材鑒別經(jīng)驗(yàn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得中藥材的分子遺傳標(biāo)記鑒別成為 可能。目前文獻(xiàn)上已有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法鑒別川貝母藥材的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種通過磁珠法提取川貝母中的DNA，利用 PCR熒光探針法來鑒別，較普通PCR法操作簡單、時間短、準(zhǔn)確率高、環(huán)保。
[0004] -種實(shí)時熒光定量PCR對川貝母的鑒別方法，依次包括下述步驟：
[0005] 1)引物的稀釋
[0006] 每管加超純水0.29ml進(jìn)行稀釋，并渦旋振蕩混勻使其充分溶解，于-20°C冰箱保存 備用；
[0007] 2)樣品的前處理
[0008] 取lg試樣，用研缽研成粉末，再精密稱取20mg至2ml滅菌離心管中；
[0009] 3)DNA 的提取
[0010]樣品的裂解:取前處理好的樣品，加入400μ1裂解緩沖液和已融化的核糖核酸酶A 5μ1，振蕩混勻;置于70°C金屬浴中10-30分鐘，期間取出振蕩混勻數(shù)次;5000轉(zhuǎn)離心10分鐘， 取上清進(jìn)行提??；
[0011] 4)磁珠法提取樣品DNA
[0012] 取出試劑盒中96位深孔板，于A行分別加入已裂解樣品300μ1，連接緩沖液600μ1， 磁珠60μ1 ;F行加入清洗緩沖液Ι500μ1 ;G行加入清洗緩沖液Π 550μ1 ;Η行加入清洗緩沖液m 550μ1;取出試劑盒中洗脫條，加入洗脫緩沖液100μΙ;將混合后的96位深孔板和洗脫條，置 于核酸提取儀，進(jìn)行DNA提?。?br>[0013] 5)PCR反應(yīng)液的配制
[0014] 每管PCR管中分別加入2x熒光定量預(yù)混試劑彩色版10μ1、正、反引物各0.5μ1及無 RNA酶ddH20 7μ1;往上述含有反應(yīng)液的PCR管中加入2μ1提取好的DNA，輕輕敲打PCR管盒，使 反應(yīng)液與DNA混勻，并經(jīng)3000轉(zhuǎn)離心3~10秒，立即進(jìn)行PCR反應(yīng)；
[0015] 6)設(shè)置熒光定量PCR儀反應(yīng)參數(shù)如下：95°C、4minl個循環(huán);95°C、30s，60°C，30s，72 °C，60s，45個循環(huán)，采集熒光；
[0016] 7)數(shù)據(jù)處理
[0017]將數(shù)據(jù)同步至電腦上，選擇"定性檢測"對試樣進(jìn)行分析。
[0018] 進(jìn)一步的，上述的一種實(shí)時熒光定量PCR對川貝母的鑒別方法，所述的熒光定量 PCR儀設(shè)置方法:檢測模式為熒光通道，反應(yīng)總體積為20μ1，染色選擇熒光染色I(xiàn)，依次選擇 預(yù)變性和三步擴(kuò)增，收集熒光。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于傳統(tǒng)的DNA提取多以試劑法提取，常因步驟多，往往提取效 率不高，以影響結(jié)果準(zhǔn)確性;本發(fā)明采用磁珠法進(jìn)行DNA提取，具有專屬性強(qiáng)、富集效率高、 操作相對簡單等特點(diǎn)。
[0020] 本發(fā)明對實(shí)時熒光定量PCR判定原則為無 Cq值，曲線為直線或輕微斜線，無明顯指 數(shù)增長期，可判為非川貝母;Cq< 30,曲線有明顯指數(shù)擴(kuò)增期，可判為川貝母。
[0021] 本發(fā)明建立了用實(shí)時熒光定量PCR來鑒別川貝母，對5批川貝母和3批其它貝母類 進(jìn)行了測試，通過Cq值和擴(kuò)增曲線圖來判斷，直觀明了，準(zhǔn)確率100%，并經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)， 重現(xiàn)性好。說明該方法對于鑒別川貝母專屬性強(qiáng)，可行性高，具有較好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0022]圖1是川貝母對照藥材、川貝母、陽性對照的qPCR檢測結(jié)果。
[0023]圖2是非川貝母類(平貝母、浙貝母和土貝母）、陰性對照的qPCR檢測結(jié)果；
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對 本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的 權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] 1.材料與儀器
[0027] 1.1藥材
[0028] 1.1.1川貝母對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121000-200405)川貝母 1、2來源于安徽亳州中藥材市場，川貝母3、4和5、平貝母、浙貝母和土貝母來源于廣西玉林 中藥材市場，并經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定確認(rèn)。
[0029] 1 . 1 . 2試劑和引物磁珠法植物DNA提取試劑盒（美國熱電公司，批號： 00LSKFR804096F25N009)；
[0030] SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(天根生化科技有限公司，批號:03120);
[0031] 川貝母引物（invitrogen公司，批號：NS0_2954885,序列為：
[0032] 5，CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3，和
[0033] 5'GCTACGTTCTTCATCGAT3'）。
[0034] 本發(fā)明所涉及到的百分濃度，沒有特別說明的，液體均為體積濃度，溶質(zhì)為固體的 指質(zhì)量濃度。
[0035] 1.2儀器XA205DU電子天平(德國梅特勒托利多公司）、Minispin臺式高速離心機(jī) (德國Eppendorf)、MINIB-100F恒溫金屬浴(杭州米歐儀器有限公司）、LightCycler96焚光 定量PCR儀(瑞士羅氏公司）、Thermo Fisher Duo核酸提取儀(美國熱電公司）。
[0036] 2 ·方法與結(jié)果
[0037] 2.1引物的稀釋每管加超純水0.29ml進(jìn)行稀釋，并渦旋振蕩混勻使其充分溶解， 于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0038] 2.2樣品的前處理取lg試樣，用研缽研成粉末，再精密稱取20mg至2ml滅菌離心管 中。
[0039] 2.3DNA 的提取
[0040] 2.3.1樣品的裂解:取前處理好的樣品，加入40(^1緩沖液和已融化的1?^86厶5以 1，振蕩混勻。置于70 °C金屬浴中10-30分鐘，期間取出振蕩混勻數(shù)次。5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取 上清進(jìn)行提取。
[0041] 2.3.2磁珠法提取樣品DNA:取出試劑盒中96位深孔板，于A行分別加入已裂解樣品 300μ1，連接緩沖液r 600μ1，磁珠60μ1 ;F行加入清洗緩沖液Ι500μ1 ;G行加入清洗緩沖液Π 550μ1; Η行加入清洗緩沖液ΙΠ 550μ1。取出試劑盒中洗脫條，加入洗脫緩沖液100μΙ。將混合 后的96位深孔板和洗脫條，置于核酸提取儀，進(jìn)行DNA提取。
[0042] 2.4PCR反應(yīng)液的配制每管PCR管中分別加入2x SuperReal PreMix Plus(DNA熒光 染料）10μ1、正、反引物各0·5μ1 及RNase-Free ddH20 7μ1。
[0043] 2.5PCR往上述含有反應(yīng)液的PCR管中加入2μ1提取好的DNA，輕輕敲打PCR管盒，使 反應(yīng)液與DNA混勻，并經(jīng)3000轉(zhuǎn)離心3~10秒，立即進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0044] 2.6熒光定量PCR儀設(shè)置
[0045] 2.6.1方法設(shè)置:檢測模式為熒光通道，反應(yīng)總體積為20μ1，染色選擇SYBR Green I，依次選擇"Pre incubation"（預(yù)變性）和"3 Step Ampl if i cat ion"（三步擴(kuò)增），選擇 Single收集熒光。
[0046] 2.6.2qPCR反應(yīng)參數(shù)按表1設(shè)置：
[0047] 表1 qPCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置
[0048]
[0049] 2.7數(shù)據(jù)處理
[0050] 將數(shù)據(jù)同步至電腦上，選擇"定性檢測"對試樣進(jìn)行分析。
[0051] 2.8結(jié)果
[0052] 結(jié)果見表2，其中川貝母對照藥材、川貝母1、2、3、4、5和陽性對照Cq值均〈30，且擴(kuò) 增曲線有明顯指數(shù)增長期，故可判定為陽性，見圖1;而其它貝母類和陰性對照均無 Cq值，且 曲線均為一條直線，故為陰性，見圖2。經(jīng)過多次重復(fù)測試，樣品結(jié)果穩(wěn)定一致，表明該方法 對川貝母的鑒別準(zhǔn)確率高、專屬性強(qiáng)。
[0053] 表2樣品的qPCR結(jié)果
[0054]
[0055] 引入了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性鑒別方法，但常規(guī)PCR存在需結(jié) 合電泳分析、無法對擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時檢測，以及EB試劑有毒害性等缺點(diǎn)。而本發(fā)明采用的 實(shí)時焚光定量PCR探針法，具有以下特點(diǎn):檢測周期短 3小時以內(nèi)、尚特異性 在延伸 中產(chǎn)生熒光需探針特異性與所檢測基因的PCR產(chǎn)物配對、環(huán)保、高靈敏度、重現(xiàn)性好。
[0056] 本發(fā)明建立了用實(shí)時熒光定量PCR來鑒別川貝母，對5批川貝母和3批其它貝母類 進(jìn)行了測試，通過Cq值和擴(kuò)增曲線圖來判斷，直觀明了，準(zhǔn)確率100%，并經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)， 重現(xiàn)性好。說明該方法對于鑒別川貝母專屬性強(qiáng)，可行性高，具有較好的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種實(shí)時熒光定量PCR對川貝母的鑒別方法，其特征在于，依次包括下述步驟： 1) 引物的稀釋 每管加超純水〇.29ml進(jìn)行稀釋，并渦旋振蕩混勻使其充分溶解，于-20°C冰箱保存?zhèn)?用； 2) 樣品的前處理 取lg試樣，用研缽研成粉末，再精密稱取20mg至2ml滅菌離心管中； 3. DNA的提取 樣品的裂解:取前處理好的樣品，加入400μ1裂解緩沖液和已融化的核糖核酸酶Α 5μ1， 振蕩混勻;置于70 °C金屬浴中10-30分鐘，期間取出振蕩混勻數(shù)次;5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上 清進(jìn)行提??； 4) 磁珠法提取樣品DNA 取出試劑盒中96位深孔板，于A行分別加入已裂解樣品300μ1，連接緩沖液600μ1，磁珠 60μ1 ;F行加入清洗緩沖液Ι500μ1 ;G行加入清洗緩沖液Π 550μ1 ;Η行加入清洗緩沖液ΙΠ 550μ 1;取出試劑盒中洗脫條，加入洗脫緩沖液1〇〇μ1;將混合后的96位深孔板和洗脫條，置于核 酸提取儀，進(jìn)行DNA提?。? 5. PCR反應(yīng)液的配制 每管PCR管中分別加入2x熒光定量預(yù)混試劑彩色版10μ1、正、反引物各0.5μ1及無 RNA酶 ddH20 7μ1;往上述含有反應(yīng)液的PCR管中加入2μ1提取好的DNA，輕輕敲打PCR管盒，使反應(yīng) 液與DNA混勻，并經(jīng)3000轉(zhuǎn)離心3~10秒，立即進(jìn)行PCR反應(yīng)； 6) 設(shè)置熒光定量PCR儀反應(yīng)參數(shù)如下：95°C、4minl個循環(huán);95 °C、30s，60 °C，30s，72°C， 60s，45個循環(huán)，采集熒光； 7) 數(shù)據(jù)處理 將數(shù)據(jù)同步至電腦上，選擇"定性檢測"對試樣進(jìn)行分析。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種實(shí)時熒光定量PCR對川貝母的鑒別方法，其特征在于，所 述的熒光定量PCR儀設(shè)置方法:檢測模式為熒光通道，反應(yīng)總體積為20μ1，染色選擇熒光染 色I(xiàn)，依次選擇預(yù)變性和三步擴(kuò)增，收集熒光。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種實(shí)時熒光定量PCR對川貝母的鑒別方法，旨在提供一種操作簡單、時間短、準(zhǔn)確率高、環(huán)保該方法依次包括下述步驟：1)引物的稀釋備用；2)樣品的前處理取1g試樣；3)DNA的提??；4)磁珠法提取樣品DNA；5)PCR反應(yīng)液的配制；6)設(shè)置熒光定量PCR儀反應(yīng)參數(shù)如下：95℃、4min1個循環(huán)；95℃、30s，60℃，30s，72℃，60s，45個循環(huán)，采集熒光；7)數(shù)據(jù)處理；屬于化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105648108
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】陳學(xué)松, 羅達(dá)龍, 黃林杰, 黃琳
【申請人】廣西壯族自治區(qū)梧州食品藥品檢驗(yàn)所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年4月15日