本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于白木香細(xì)胞培養(yǎng)提取倍半萜的方法。

背景技術(shù)：

白木香（Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg）別名土沉香、女兒香、牙香樹(shù)、莞香、六麻樹(shù)，為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬植物，是一種熱帶、亞熱帶常綠喬木。但因過(guò)度采伐，遭到了毀滅性打擊，野生白木香已所剩無(wú)幾，現(xiàn)已被列為國(guó)家珍稀瀕危三級(jí)保護(hù)植物及國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物。

現(xiàn)有技術(shù)中懸浮細(xì)胞系的誘導(dǎo)多采用莖尖作為外植體，消毒過(guò)程不充分，會(huì)導(dǎo)致愈傷組織誘導(dǎo)存活率低，污染率高等問(wèn)題。其次現(xiàn)有技術(shù)中采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以及懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基存在誘導(dǎo)率較低以及懸浮細(xì)胞細(xì)胞活性較低等問(wèn)題。

現(xiàn)有的技術(shù)方法中沉香的誘導(dǎo)多數(shù)在白木香樹(shù)木上結(jié)合真菌、化合物等進(jìn)行誘導(dǎo)，存在操作困難，誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。誘導(dǎo)獲得的沉香再經(jīng)過(guò)加工后提取獲得沉香倍半萜，增加了成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于白木香細(xì)胞培養(yǎng)提取倍半萜的方法，該方法提取率高，培養(yǎng)周期短，操作簡(jiǎn)單化，成本低。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種基于白木香細(xì)胞培養(yǎng)提取倍半萜的方法，包括如下步驟：

（1）取材消毒：取白木香果莢作為材料，進(jìn)行消毒處理，備用；

（2）無(wú)菌苗誘導(dǎo)：將消毒處理后的白木香果莢的種子取出，進(jìn)行無(wú)菌苗的誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到白木香無(wú)菌苗；

（3）愈傷組織誘導(dǎo)：將誘導(dǎo)出來(lái)的白木香無(wú)菌苗的幼葉取出，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到白木香愈傷組織；

（4）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：將誘導(dǎo)出來(lái)的白木香愈傷組織取出，進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，得到白木香懸浮細(xì)胞；

（5）共培養(yǎng)：取誘導(dǎo)的白木香懸浮細(xì)胞，處理后接入結(jié)香菌種進(jìn)行共培養(yǎng)；

（6）提取倍半萜：白木香懸浮細(xì)胞在結(jié)香菌種的誘導(dǎo)下積累次生代謝產(chǎn)物倍半萜，提取倍半萜。

優(yōu)選的，所述步驟（1）具體為：取成熟的白木香果莢作為材料，先用洗潔精水中浸泡15-25min，清洗表面污漬，流水沖洗2-4h；再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08-0.12%的升汞溶液浸泡處理10-20min，無(wú)菌水沖洗3-7次，用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，備用。

優(yōu)選的，所述步驟（2）具體為：將消毒處理過(guò)的白木香果莢的種子取出，接種在添加有0.4-0.6mg/L 6-BA的改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行無(wú)菌苗的誘導(dǎo)培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入18-22mL培養(yǎng)基接種8-10粒種子。

優(yōu)選的，所述步驟（2）中，誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：光照強(qiáng)度700-900lx，光照時(shí)間9-11h/d，溫度26-28℃，培養(yǎng)13-17d。

優(yōu)選的，所述步驟（3）中，將誘導(dǎo)出來(lái)的白木香無(wú)菌苗的幼葉取出，葉片大小0.4-0.6cm×0.4-0.6cm，接入在18-22mL添加有1.5-1.9mg/L NAA和1.1-1.5mg/L 6-BA的改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23-25℃，暗培養(yǎng)18-22d后繼代。

優(yōu)選的，所述步驟（4）中，取繼代5次的白木香愈傷組織用鑷子夾碎后放入添加有1.5-1.9mg/L NAA、1.1-1.5mg/L KT和400.0-600.0mg/L CH的改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，每230-270mL錐形瓶放入80-100mL培養(yǎng)基，接種量為1.3-1.7g，用無(wú)菌紗布過(guò)濾，取濾液進(jìn)行培養(yǎng)，繼代4次后獲得細(xì)胞活性均一的培養(yǎng)物,得到白木香懸浮細(xì)胞。

優(yōu)選的，所述步驟（4）中，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的條件為：水平震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速100-120r/min，光照強(qiáng)度400-600lx，光照時(shí)間8-10h/d，溫度26-28℃，培養(yǎng)6-8d。

優(yōu)選的，所述步驟（5）具體為：取誘導(dǎo)的白木香懸浮細(xì)胞180-220mL加入25-35μM的茉莉酸甲酯處理20-28h后，接入結(jié)香菌種2-4g，水平震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速100-120r/min，共培養(yǎng)13-17d。

優(yōu)選的，所述步驟（6）具體為：白木香懸浮細(xì)胞在結(jié)香菌種的誘導(dǎo)下積累次生代謝產(chǎn)物倍半萜，精密稱取于55-65℃溫度下干燥至恒重的樣品，回流提取，定容過(guò)濾后，得到次生代謝產(chǎn)物倍半萜。

優(yōu)選的，所述步驟（2）-（4）中，改良MS培養(yǎng)基包括如下組分：

KNO₃ 900-1000mg/L

NH₄NO₃ 800-850mg/L

MgSO₄?7H₂O 170-200mg/L

KH₂PO₄ 75-95mg/L

CaCl₂?2H₂O 200-240mg/L

MnSO₄?4H₂O 10-12mg/L

ZnSO₄?7H₂O 3.8-4.8mg/L

H₃BO₃ 2.6-3.6mg/L

KI 0.40-0.44mg/L

Na₂MO₄?7H₂O 0.11-0.15mg/L

CuSO₄·5H₂O 0.011-0.015mg/L

CoCL₂·6H₂O 0.011-0.015mg/L

Na₂-EDTA 35-40mg/L

FeSO₄·4H₂O 25-30mg/L

甘氨酸 1.5-2.5mg/L

鹽酸吡哆醇 0.3-0.7mg/L

鹽酸硫銨素 0.05-0.15mg/L

煙酸 0.3-0.7mg/L

肌酸 80-120mg/L。

更為優(yōu)選的，改良MS培養(yǎng)基包括如下組分：

KNO₃ 950mg/L

NH₄NO₃ 825mg/L

MgSO₄?7H₂O 185mg/L

KH₂PO₄ 85mg/L

CaCl₂?2H₂O 220mg/L

MnSO₄?4H₂O 11.15mg/L

ZnSO₄?7H₂O 4.3mg/L

H₃BO₃ 3.1mg/L

KI 0.42mg/L

Na₂MO₄?7H₂O 0.13mg/L

CuSO₄·5H₂O 0.013mg/L

CoCL₂·6H2O 0.013mg/L

Na₂-EDTA 37.3mg/L

FeSO₄·4H₂O 27.8mg/L

甘氨酸 2.0mg/L

鹽酸吡哆醇 0.5mg/L

鹽酸硫銨素 0.1mg/L

煙酸 0.5mg/L

肌酸 100mg/L。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的方法以白木香果莢為外植體，經(jīng)消毒后，接種在萌發(fā)培養(yǎng)基上面誘導(dǎo)種子發(fā)芽，得到無(wú)菌苗。隨后取無(wú)菌苗幼嫩組織進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。接入篩選出的培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，得到形態(tài)結(jié)構(gòu)優(yōu)良、活力良好的愈傷組織后。將愈傷組織放入液體培養(yǎng)基進(jìn)行液體懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，得到高效的白木香懸浮細(xì)胞系。將白木香懸浮細(xì)胞系與結(jié)香菌共同培養(yǎng)，在結(jié)香真菌的誘導(dǎo)下積累白木香次生代謝產(chǎn)物倍半萜。

本發(fā)明的方法中白木香外植體在不同種類及不同濃度植物激素的培養(yǎng)條件下進(jìn)行離體培養(yǎng)。篩選出最佳的激素種類和濃度配比，建立高效的白木香懸浮細(xì)胞系誘導(dǎo)方法。隨后白木香懸浮細(xì)胞系與結(jié)香菌（色二孢菌、黃綠墨耳菌）共同培養(yǎng)，誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物的積累，為利用白木香懸浮細(xì)胞的生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、在使用白木香果莢作為材料，消毒誘導(dǎo)得到愈傷組織的過(guò)程中，污染率大大降低,且愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到了86%。

2、通過(guò)本發(fā)明選出的培養(yǎng)基以及誘導(dǎo)方法可以得到高細(xì)胞活性的白木香懸浮細(xì)胞，在結(jié)香菌種和茉莉酸甲酯處理下，可以短時(shí)間內(nèi)刺激次生代謝產(chǎn)物的大量積累。

3、白木香懸浮細(xì)胞系與結(jié)香菌共同培養(yǎng)后提取次生代謝產(chǎn)物存在培養(yǎng)周期短、操作簡(jiǎn)單化、成本低等優(yōu)點(diǎn)，共培養(yǎng)后其次生代謝產(chǎn)物的提取率達(dá)到2.3%。

具體實(shí)施方式

為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，實(shí)施方式提及的內(nèi)容并非對(duì)本發(fā)明的限定。

實(shí)施例1

一種基于白木香細(xì)胞培養(yǎng)提取倍半萜的方法，包括如下步驟：

（1）取材消毒：取成熟的白木香果莢作為材料，先用洗潔精水中浸泡15min，清洗表面污漬，流水沖洗2h；在超凈工作臺(tái)上用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%的升汞溶液浸泡處理10min，無(wú)菌水沖洗3次，用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，備用。

（2）無(wú)菌苗誘導(dǎo)：將消毒處理過(guò)的白木香果莢用鑷子把種子取出，接種在添加有0.4mg/L 6-BA的改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行無(wú)菌苗的誘導(dǎo)培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入18mL培養(yǎng)基接種8粒種子；誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：光照強(qiáng)度700lx，光照時(shí)間9h/d，溫度26℃，培養(yǎng)13d。

（3）愈傷組織誘導(dǎo)：將誘導(dǎo)出來(lái)的白木香無(wú)菌苗的幼葉取出，葉片大小0.4cm×0.4cm，接入在18mL添加有1.5mg/L NAA和1.1mg/L 6-BA的改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23℃，暗培養(yǎng)18d后繼代。

（4）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：取繼代5次的白木香愈傷組織用鑷子夾碎后放入添加有1.5mg/L NAA、1.1mg/L KT和400.0mg/L CH的改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，每230mL錐形瓶放入80mL培養(yǎng)基，接種量為1.3g，用無(wú)菌紗布過(guò)濾，取濾液進(jìn)行培養(yǎng)，繼代4次后獲得細(xì)胞活性均一的培養(yǎng)物,得到白木香懸浮細(xì)胞；懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的條件為：水平震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速100r/min，光照強(qiáng)度400lx，光照時(shí)間8h/d，溫度26℃，培養(yǎng)6d。

（5）共培養(yǎng)：取誘導(dǎo)的白木香懸浮細(xì)胞180mL加入25μM的茉莉酸甲酯處理20h后，接入結(jié)香菌種2g，水平震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速100r/min，共培養(yǎng)13d。

（6）提取倍半萜：白木香懸浮細(xì)胞在結(jié)香菌種的誘導(dǎo)下積累次生代謝產(chǎn)物倍半萜，精密稱取于55℃溫度下干燥至恒重的樣品，回流提取，定容過(guò)濾后，得到次生代謝產(chǎn)物倍半萜4.8g,提取率2.3%。

所述步驟（2）-（4）中，改良MS培養(yǎng)基包括如下組分：

KNO₃ 900mg/L

NH₄NO₃ 800mg/L

MgSO₄?7H₂O 170mg/L

KH₂PO₄ 75mg/L

CaCl₂?2H₂O 200mg/L

MnSO₄?4H₂O 10mg/L

ZnSO₄?7H₂O 3.8mg/L

H₃BO₃ 2.6mg/L

KI 0.40mg/L

Na₂MO₄?7H₂O 0.11mg/L

CuSO₄·5H₂O 0.011mg/L

CoCL₂·6H₂O 0.011mg/L

Na₂-EDTA 35mg/L

FeSO₄·4H₂O 25mg/L

甘氨酸 1.5mg/L

鹽酸吡哆醇 0.3mg/L

鹽酸硫銨素 0.05mg/L

煙酸 0.3mg/L

肌酸 80mg/L。

實(shí)施例2

一種基于白木香細(xì)胞培養(yǎng)提取倍半萜的方法，包括如下步驟：

（1）取材消毒：取成熟的白木香果莢作為材料，先用洗潔精水中浸泡20min，清洗表面污漬，流水沖洗3h；在超凈工作臺(tái)上用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%的升汞溶液浸泡處理15min，無(wú)菌水沖洗5次，用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，備用。

（2）無(wú)菌苗誘導(dǎo)：將消毒處理過(guò)的白木香果莢用鑷子把種子取出，接種在添加有0.5mg/L 6-BA的改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行無(wú)菌苗的誘導(dǎo)培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入20mL培養(yǎng)基接種9粒種子；誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：光照強(qiáng)度800lx，光照時(shí)間10h/d，溫度27℃，培養(yǎng)15d。

（3）愈傷組織誘導(dǎo)：將誘導(dǎo)出來(lái)的白木香無(wú)菌苗的幼葉取出，葉片大小0.5cm×0.5cm，接入在20mL添加有1.7mg/L NAA和1.3mg/L 6-BA的改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24℃，暗培養(yǎng)20d后繼代。

（4）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：取繼代5次的白木香愈傷組織用鑷子夾碎后放入添加有1.7mg/L NAA、1.3mg/L KT和500.0mg/L CH的改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，每250mL錐形瓶放入90mL培養(yǎng)基，接種量為1.5g，用無(wú)菌紗布過(guò)濾，取濾液進(jìn)行培養(yǎng)，繼代4次后獲得細(xì)胞活性均一的培養(yǎng)物,得到白木香懸浮細(xì)胞；懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的條件為：水平震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速110r/min，光照強(qiáng)度500lx，光照時(shí)間9h/d，溫度27℃，培養(yǎng)7d。

（5）共培養(yǎng)：取誘導(dǎo)的白木香懸浮細(xì)胞200mL加入30μM的茉莉酸甲酯處理24h后，接入結(jié)香菌種3g，水平震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速110r/min，共培養(yǎng)15d。

（6）提取倍半萜：白木香懸浮細(xì)胞在結(jié)香菌種的誘導(dǎo)下積累次生代謝產(chǎn)物倍半萜，精密稱取于60℃溫度下干燥至恒重的樣品，回流提取，定容過(guò)濾后，得到次生代謝產(chǎn)物倍半萜5.0g,提取率2.4%。

所述步驟（2）-（4）中，改良MS培養(yǎng)基包括如下組分：

KNO₃ 950mg/L

NH₄NO₃ 825mg/L

MgSO₄?7H₂O 185mg/L

KH₂PO₄ 85mg/L

CaCl₂?2H₂O 220mg/L

MnSO₄?4H₂O 11.15mg/L

ZnSO₄?7H₂O 4.3mg/L

H₃BO₃ 3.1mg/L

KI 0.42mg/L

Na₂MO₄?7H₂O 0.13mg/L

CuSO₄·5H₂O 0.013mg/L

CoCL₂·6H2O 0.013mg/L

Na₂-EDTA 37.3mg/L

FeSO₄·4H₂O 27.8mg/L

甘氨酸 2.0mg/L

鹽酸吡哆醇 0.5mg/L

鹽酸硫銨素 0.1mg/L

煙酸 0.5mg/L

肌酸 100mg/L。

實(shí)施例3

一種基于白木香細(xì)胞培養(yǎng)提取倍半萜的方法，包括如下步驟：

（1）取材消毒：取成熟的白木香果莢作為材料，先用洗潔精水中浸泡25min，清洗表面污漬，流水沖洗4h；在超凈工作臺(tái)上用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%的升汞溶液浸泡處理20min，無(wú)菌水沖洗7次，用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，備用。

（2）無(wú)菌苗誘導(dǎo)：將消毒處理過(guò)的白木香果莢用鑷子把種子取出，接種在添加有0.6mg/L 6-BA的改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行無(wú)菌苗的誘導(dǎo)培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入22mL培養(yǎng)基接種10粒種子；誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：光照強(qiáng)度900lx，光照時(shí)間11h/d，溫度28℃，培養(yǎng)17d。

（3）愈傷組織誘導(dǎo)：將誘導(dǎo)出來(lái)的白木香無(wú)菌苗的幼葉取出，葉片大小0.6cm×0.6cm，接入在22mL添加有1.9mg/L NAA和1.5mg/L 6-BA的改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，暗培養(yǎng)22d后繼代。

（4）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：取繼代5次的白木香愈傷組織用鑷子夾碎后放入添加有1.9mg/L NAA、1.5mg/L KT和600.0mg/L CH的改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，每270mL錐形瓶放入100mL培養(yǎng)基，接種量為1.7g，用無(wú)菌紗布過(guò)濾，取濾液進(jìn)行培養(yǎng)，繼代4次后獲得細(xì)胞活性均一的培養(yǎng)物,得到白木香懸浮細(xì)胞；懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的條件為：水平震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120r/min，光照強(qiáng)度600lx，光照時(shí)間10h/d，溫度28℃，培養(yǎng)8d。

（5）共培養(yǎng)：取誘導(dǎo)的白木香懸浮細(xì)胞220mL加入35μM的茉莉酸甲酯處理28h后，接入結(jié)香菌種4g，水平震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120r/min，共培養(yǎng)17d。

（6）提取倍半萜：白木香懸浮細(xì)胞在結(jié)香菌種的誘導(dǎo)下積累次生代謝產(chǎn)物倍半萜，精密稱取于65℃溫度下干燥至恒重的樣品，回流提取，定容過(guò)濾后，得到次生代謝產(chǎn)物倍半5.2g,提取率2.5%。

所述步驟（2）-（4）中，改良MS培養(yǎng)基包括如下組分：

KNO₃ 1000mg/L

NH₄NO₃ 850mg/L

MgSO₄?7H₂O 200mg/L

KH₂PO₄ 95mg/L

CaCl₂?2H₂O 240mg/L

MnSO₄?4H₂O 12mg/L

ZnSO₄?7H₂O 4.8mg/L

H₃BO₃ 3.6mg/L

KI 0.44mg/L

Na₂MO₄?7H₂O 0.15mg/L

CuSO₄·5H₂O 0.015mg/L

CoCL₂·6H₂O 0.015mg/L

Na₂-EDTA 40mg/L

FeSO₄·4H₂O 30mg/L

甘氨酸 2.5mg/L

鹽酸吡哆醇 0.7mg/L

鹽酸硫銨素 0.15mg/L

煙酸 0.7mg/L

肌酸 120mg/L。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)現(xiàn)方案，除此之外，本發(fā)明還可以其它方式實(shí)現(xiàn)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見(jiàn)的替換均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。