本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種高效構(gòu)建斑馬魚helt基因大片段缺失的方法和應(yīng)用，特別是利用crispr系統(tǒng)在斑馬魚helt基因簇中進(jìn)行基因組大片段刪除且首次刪除bhlh-sf蛋白結(jié)構(gòu)，高效構(gòu)建用于研究由基因組大片段缺失導(dǎo)致阿爾茲海默癥疾病動(dòng)物模型。

背景技術(shù)：

1、母源因子的功能紊亂是導(dǎo)致不育和先天性畸形的重要原因之一。對(duì)母源因子功能的深入分析有助于揭示這些出生缺陷的成因，并據(jù)此制定有效的應(yīng)對(duì)策略。在斑馬魚中，存在大量基因具有顯著的母源輸入，這些基因在胚胎發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。然而，傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法在研究母源基因功能時(shí)面臨諸多挑戰(zhàn)，主要包括母源突變體產(chǎn)生耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)和純合致死或不育表型導(dǎo)致難以獲得突變體后代等問(wèn)題。

2、crispr/cas9系統(tǒng)作為一種強(qiáng)大的基因編輯工具，已經(jīng)在多種生物體中得到了廣泛應(yīng)用。然而，在斑馬魚早期胚胎中直接注射cas9rnp進(jìn)行基因編輯時(shí)，產(chǎn)生的突變類型多以小的插入缺失(indel)為主，難以獲得大片段的基因刪除。這在一定程度上限制了其在研究復(fù)雜基因功能方面的應(yīng)用。

3、傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法獲取母源突變體通常需要多個(gè)世代的反復(fù)篩選，耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年。在斑馬魚早期胚胎中直接注射cas9rnp產(chǎn)生的突變類型單一，以大片段刪除為主的突變類型難以獲得。

4、基于此，本發(fā)明旨在提供一種高效構(gòu)建斑馬魚helt基因大片段缺失的方法和應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種高效構(gòu)建斑馬魚helt基因大片段缺失的方法和應(yīng)用，為解決現(xiàn)有技術(shù)中基因組大片段刪除效率低的問(wèn)題，本發(fā)明的主要目的在于提供高效構(gòu)建helt基因組大片段刪除突變體的方法且首次刪除bhlh-sf蛋白結(jié)構(gòu)，特別是通過(guò)crispr系統(tǒng)在斑馬魚helt基因中進(jìn)行基因組大片段刪除，大大提高基因組大片段刪除效率。本發(fā)明的另一目的在于首次提供上述高效構(gòu)建helt基因組大片段刪除突變體缺失且首次刪除bhlh-sf蛋白結(jié)構(gòu)所導(dǎo)致的阿爾茲海默癥疾病動(dòng)物模型中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明還提供所述一種高效構(gòu)建斑馬魚helt基因大片段缺失的方法在構(gòu)建用于由基因組大片段缺失導(dǎo)致的阿爾茲海默癥疾病治療和藥物篩選的動(dòng)物模型中的應(yīng)用。

3、進(jìn)一步地，所述基因組大片段為bhlh-sf蛋白結(jié)構(gòu)。

4、本發(fā)明還提供所述一種高效構(gòu)建斑馬魚helt基因大片段缺失的方法在脊椎動(dòng)物的基因組內(nèi)基因大片段刪除中的應(yīng)用。

5、本發(fā)明提供的一種高效構(gòu)建斑馬魚helt基因大片段缺失的方法，包括以下步驟：

6、s1、在設(shè)計(jì)待刪除基因片段兩端分別設(shè)計(jì)不少于2個(gè)特異性靶點(diǎn)；以grna骨架質(zhì)粒為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到pcr產(chǎn)物；純化、轉(zhuǎn)錄后獲得若干grna；隨后將獲得的grna與cas9蛋白分別顯微注射導(dǎo)入到所述處理對(duì)象的一細(xì)胞期受精卵中；

7、s2、挑選所述處理對(duì)象胚胎期的卵提取基因組，分別用敲除靶點(diǎn)檢測(cè)引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物；將得到的pcr產(chǎn)物sanger測(cè)序；從待刪除基因片段兩端的特異性crispr靶點(diǎn)組成若干組最優(yōu)靶點(diǎn)組合和分開單獨(dú)組合；選取最優(yōu)靶點(diǎn)組合分別進(jìn)行顯微注射導(dǎo)入到所述處理對(duì)象的一細(xì)胞期受精卵中；挑選所述處理對(duì)象胚胎期的卵提取基因組，經(jīng)過(guò)雙外側(cè)引物pcr擴(kuò)增，進(jìn)行穩(wěn)定培養(yǎng)，得到斑馬魚helt基因大片段缺失的突變體。

8、進(jìn)一步地，所述靶點(diǎn)序列如下表所示：

9、 靶點(diǎn)名稱 序列5-3 靶位點(diǎn)1 tgagaagagctgaccggagg 靶位點(diǎn)2 gactgagaagagctgaccgg 靶位點(diǎn)3 agtctgaagcgtctggaaag 靶位點(diǎn)4 acgcgcacactcgatgctct 靶位點(diǎn)5 catcgctgggtaggcgagcg 靶位點(diǎn)6 ccgctgtgctgagacatcgc 靶位點(diǎn)7 tgtgtaagctgaaggcattg

10、進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增引物的序列如下表所示：

11、 特異性引物 序列 正向引物(f) gtggaacagaaagggacg 反向引物(r) gtgtatgctgcaaatgaaat

12、進(jìn)一步地，所述grna的終濃度為120-160ng/μl，cas9蛋白的終濃度為400ng/μl，注射量為1nl。

13、進(jìn)一步地，所述一種高效構(gòu)建斑馬魚helt基因大片段缺失的方法同時(shí)滿足：

14、所述處理對(duì)象的基因組大片段刪除效率與其單個(gè)特異性crispr靶點(diǎn)的誘變效率呈正相關(guān)；與同時(shí)顯微注射不少于兩個(gè)特異性crispr靶點(diǎn)相比顯微注射具有高誘變效率的最優(yōu)靶點(diǎn)組合的基因組大片段刪除效率高。

15、進(jìn)一步地，通過(guò)上述一種高效構(gòu)建斑馬魚helt基因大片段缺失的方法在斑馬魚helt基因簇中進(jìn)行基因組大片段刪除，包括以下步驟：

16、(1)在斑馬魚的helt基因簇中確定基因敲除的靶點(diǎn)序列，在符合crispr?pam區(qū)的條件下，待刪除基因片段兩端分別設(shè)計(jì)不少于3個(gè)特異性crispr。

17、grna靶點(diǎn)序列；

18、(2)根據(jù)步驟(1)設(shè)計(jì)的特異性crispr?grna靶點(diǎn)序列分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物；

19、(3)以grna骨架質(zhì)粒為模板，采用引物t7-grnatarget作為正向引物和grna反向引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物；

20、(4)步驟(3)得到的pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化，體外轉(zhuǎn)錄，獲得grna；

21、(5)步驟(4)得到的grna與cas9蛋白顯微注射導(dǎo)入到斑馬魚的一細(xì)胞期受精卵中；

22、(6)挑選步驟(5)中斑馬魚48h胚胎期的魚卵提取基因組，用敲除靶點(diǎn)檢測(cè)引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物；

23、(7)步驟(6)得到的pcr產(chǎn)物依次進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，測(cè)序分析敲除情況；

24、(8)從待刪除基因片段兩端的特異性crispr靶點(diǎn)中選取1組特異性crispr靶點(diǎn)組成最優(yōu)靶點(diǎn)組合；

25、(9)步驟(8)中得到的最優(yōu)靶點(diǎn)組合分別顯微注射導(dǎo)入到斑馬魚的一細(xì)胞期受精卵中；

26、(10)挑選步驟(9)中斑馬魚48h胚胎期的魚卵提取基因組，依次經(jīng)過(guò)雙外側(cè)引物pcr擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，穩(wěn)定培養(yǎng)得到得斑馬魚基因組大片段刪除的阿爾茲海默癥突變體。

27、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

28、1、本發(fā)明首創(chuàng)性地識(shí)別并篩選出具備卓越突變能力的helt-grna，并開創(chuàng)性地移除了bhlh-sf蛋白結(jié)構(gòu)。隨后，我們精心挑選出高效的grna組合，通過(guò)顯微注射技術(shù)精準(zhǔn)地導(dǎo)入至一細(xì)胞階段的斑馬魚受精卵中，利用crispr技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高效的基因組大片段編輯。這一過(guò)程確保了大片段刪除的效率與單個(gè)crispr靶點(diǎn)的特異性誘變能力直接正相關(guān)；且相比其他基因組編輯方法，采用最優(yōu)靶點(diǎn)組合的顯微注射策略展現(xiàn)了更高的誘變效率及大片段刪除效能。

29、2、本發(fā)明聚焦于斑馬魚基因組的多位點(diǎn)精準(zhǔn)編輯，通過(guò)精心設(shè)計(jì)針對(duì)特定靶點(diǎn)的grna，我們成功地將一對(duì)靶向特定基因的grna與cas9蛋白聯(lián)合注入到一細(xì)胞期的胚胎細(xì)胞中。利用crispr/cas9系統(tǒng)的強(qiáng)大功能，我們?cè)诎唏R魚的helt基因簇內(nèi)實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)達(dá)1.4kb的基因組大片段刪除，平均編輯效率超過(guò)50％，顯著提升了此類編輯的效率和可行性。

30、3、本發(fā)明的技術(shù)不僅在斑馬魚的helt基因簇上實(shí)現(xiàn)了高效的基因片段刪除，還首次通過(guò)刪除bhlh-sf蛋白結(jié)構(gòu)構(gòu)建了阿爾茨海默病模型。這些攜帶基因組大片段刪除的斑馬魚突變體，作為寶貴的動(dòng)物模型，可用于深入探究基因組大片段缺失相關(guān)疾病的病理機(jī)制。尤為重要的是，本發(fā)明首次在斑馬魚體系中成功獲得bhlh-sf蛋白缺失突變體，這些突變體展現(xiàn)出阿爾茨海默病樣癥狀，包括生長(zhǎng)遲緩、腦部及尾部發(fā)育異常等，為魚類乃至更廣泛生物體的生長(zhǎng)發(fā)育研究開辟了新的視角和實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。