本發(fā)明屬于植物誘導(dǎo)再生，尤其涉及吉祥草的高效人工繁殖方法。

背景技術(shù)：

1、吉祥草[reineckea?carnea(andrews)kunth.]又名小葉萬年青、觀音草、紫衣草、松壽蘭等，為百合科liliaceae吉祥草屬reineckea單屬單種多年生常綠草本植物；喜好溫暖、濕潤(rùn)的環(huán)境，較耐寒耐陰，適應(yīng)性強(qiáng)；多生于海拔170-3200m的陰濕山坡、山谷或密林下。吉祥草為中國(guó)西南諸省苗族傳統(tǒng)草藥，日本和印度亦有廣布；在我國(guó)主要分布于江蘇、湖南、湖北、河南、陜西、貴州、四川、云南等各省區(qū)。吉祥草味苦、性平，全草入藥，其植株中含有甾體類、黃酮類、萜類等化學(xué)成分，主要藥效成分為皂苷類化合物，具有溶血、抗炎、潤(rùn)肺止咳等功效；在苗族地區(qū)常用于治療咳嗽、支氣管炎、肺結(jié)核咳嗽；也可用于補(bǔ)腎壯腰、咯血、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，外用可治跌打損傷。吉祥草一名最早見于《本草拾遺》中；《植物名實(shí)圖考》曰：“松壽蘭，葉微寬，花六出稍大，冬開，盤盎中植之。秋結(jié)實(shí)如天門冬，實(shí)色紅紫有尖?！奔椴葜晷蛢?yōu)美，葉色翠綠，是非常好的家庭裝飾花卉；其終年常綠，覆蓋性好，可大面積種于園路邊美化環(huán)境，且根系發(fā)達(dá)，亦是喀斯特石漠化生態(tài)修復(fù)草本中最佳物種之一。近年來，吉祥草商業(yè)價(jià)值及藥用價(jià)值逐漸被挖掘，其需求量大大增加。吉祥草的傳統(tǒng)繁殖方法主要有種子和分株繁殖2種方式，均存在繁殖周期長(zhǎng)、易變異、成活率低，植株弱小，易感染病毒等問題，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到規(guī)?；a(chǎn)的要求。因此，需要一種快捷和高效的方法來獲得大量遺傳穩(wěn)定的種苗，而利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)是規(guī)模化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)吉祥草的最佳方案之一。

2、組織培養(yǎng)技術(shù)不僅有生長(zhǎng)快、周期短、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，且材料來源單一，可保留植株原有的優(yōu)良性狀，短期能獲大量遺傳性質(zhì)高度一致的種苗。植物離體培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，為藥用植物資源稀缺提供了有效的保障。面對(duì)吉祥草的野生資源的逐漸減少，而人工種植所需種苗極度匱乏，急需尋求一種新的成本低、時(shí)間短、質(zhì)量和成活率高，且能將母本優(yōu)良性狀固定下來的無性繁殖方法來擴(kuò)大吉祥草種苗的繁殖量，進(jìn)行高品質(zhì)種苗的工廠化生產(chǎn)，以滿足種植需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于通過直接器官發(fā)生方式解決吉祥草種苗缺乏并避免實(shí)生苗所存在的周期長(zhǎng)、羸弱瘦小、變異在、成活率低等問題，該方法可為固定母本優(yōu)良性狀、發(fā)展人工種植奠定技術(shù)基礎(chǔ)。通過本發(fā)明，可提供基因型背景一致的吉祥草優(yōu)質(zhì)種苗以滿足人工種植的需求。

2、為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、吉祥草的高效人工繁殖方法，包括的步驟有：將消毒滅菌處理后的根莖芽切割為適當(dāng)大小，接種于培養(yǎng)基進(jìn)行基莖叢生芽誘導(dǎo)、生根及煉苗移栽。

4、進(jìn)一步地，所述的吉祥草的高效人工繁殖方法，包括以下步驟：

5、(1)外植體的獲?。哼x擇生長(zhǎng)勢(shì)好、無病蟲害的健壯植株，取其一年生根芽；

6、(2)將(1)步驟的根莖芽進(jìn)行消毒處理；

7、(3)將經(jīng)過(2)步驟消毒滅菌好的根莖芽切為適當(dāng)大小，接入下列培養(yǎng)基a中，所述培養(yǎng)基a，包括以下原料：

8、ms基本培養(yǎng)液

9、6-芐胺基嘌呤(6-ba)

10、蔗糖

11、瓊脂粉

12、控制光照度、溫度、光照時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)，即可獲得略有增殖效應(yīng)的無菌試管苗；

13、(4)基莖叢生芽的發(fā)生和增殖培養(yǎng)：將(3)步驟中培養(yǎng)的增殖苗轉(zhuǎn)入下列b培養(yǎng)基中，所述b培養(yǎng)基，包括以下原料：

14、ms基本培養(yǎng)液

15、6-芐胺基嘌呤(6-ba)

16、α-萘乙酸(naa)

17、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)

18、烯效唑(s-3307)

19、蔗糖

20、瓊脂粉

21、控制光照度、溫度、光照時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)，即可在培養(yǎng)物基部獲得大量的叢生芽；

22、(5)取(4)步驟簇壯叢芽，剪切為適當(dāng)大小，單苗接種于下列c培養(yǎng)基中，所述c培養(yǎng)基，包括以下原料：

23、1/2ms基本培養(yǎng)液

24、吲哚丁酸(iba)

25、蔗糖

26、瓊脂粉

27、控制光照度、溫度、光照時(shí)間的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，即可獲得苗壯根粗的生根苗；

28、(6)煉苗和移栽：取(5)步驟中的生根植株置于室溫下煉苗，從培養(yǎng)基中取出幼苗，將殘留培養(yǎng)基清洗干凈，放入多菌靈溶液中消毒，后移栽至經(jīng)消毒的腐殖質(zhì)土中保溫保濕培養(yǎng)，即得移栽苗。

29、進(jìn)一步地，步驟(2)中所述根莖芽進(jìn)行消毒處理的方法為：用自來水洗凈表面后用質(zhì)量百分比10％洗衣粉溶液浸泡10min并輕微震蕩攪動(dòng)后流水沖洗30min，置于超凈工作臺(tái)上用體積百分比75％乙醇溶液處理10-15s，再用質(zhì)量百分比0.1％升汞水溶液滅菌10-12min，最后無菌水沖洗3次，每次不低于3min，在整個(gè)消毒過程中充分搖動(dòng)器皿。

30、進(jìn)一步地，(3)步驟中所述培養(yǎng)基a，包括以下原料：

31、ms基本培養(yǎng)液：

32、6-芐胺基嘌呤(6-ba)?1.5-2.0mg/l

33、蔗糖?30000mg/l

34、瓊脂粉?4700mg/l。

35、進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基a的ph值為5.4-5.8。

36、進(jìn)一步地，將(3)步驟中的材料分割為0.5×0.5cm、芽高2.0cm左右轉(zhuǎn)接到b培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基b，包括以下原料：

37、ms基本培養(yǎng)液

38、

39、

40、進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基b的ph值為5.4-5.8。

41、進(jìn)一步地，還包括以下步驟：將(4)步驟中叢生苗分割為單芽，轉(zhuǎn)接入(5)步驟中培養(yǎng)基c中，所述培養(yǎng)基c，包括以下原料：

42、1/2ms基本培養(yǎng)液

43、吲哚丁酸(iba)?1.5-2.0mg/l

44、蔗糖?30000mg/l

45、瓊脂粉?4700mg/l。

46、進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基b的ph值為5.4-5.8。

47、進(jìn)一步地，(6)步驟中所述基質(zhì)消毒方法為，質(zhì)量濃度為0.05-0.1％的高錳酸鉀溶液噴撒至腐質(zhì)土中，微濕后用塑料薄膜密封一周，備用。

48、進(jìn)一步地，(6)步驟中所述多菌靈溶液的質(zhì)量濃度為0.1-0.2％。

49、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

50、(1)本發(fā)明用組織培養(yǎng)技術(shù)在培養(yǎng)室內(nèi)可實(shí)現(xiàn)周年生產(chǎn)，既節(jié)約了土地資源，又提高了經(jīng)濟(jì)效益，克服了傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)繁殖方式無法周年進(jìn)行生產(chǎn)的難點(diǎn)；

51、(2)本發(fā)明利用吉祥草根莖芽，通過直接器官發(fā)生方式，可最大程度固定母本優(yōu)良性狀，避免了間接器官發(fā)生方式可能產(chǎn)生的變異；

52、(3)本發(fā)明在無菌體系建立后，僅需兩種培養(yǎng)基中就可利用直接器官發(fā)生方式完成增殖和生根過程，既可在滿足大規(guī)模生產(chǎn)需要的同時(shí)，又保持了母本的優(yōu)良性狀，為其人工快繁最有效的增殖方式，且提高了種苗質(zhì)量；

53、(4)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了高效快繁的目的，60d為一個(gè)增殖培養(yǎng)周期，繁殖系數(shù)可達(dá)10.0以上；

54、(5)通過本發(fā)明生產(chǎn)的吉祥草試管苗，由于每一株均具大小不一的小塊莖，移栽成活率高，且生長(zhǎng)迅速，目前已由云南呦陽生物科技有限公司在四川涼山普格縣進(jìn)行示范栽培，效果很好；

55、(6)本發(fā)明對(duì)吉祥草人工快速繁殖具有重要意義和價(jià)值，同時(shí)也可為其他多年生根狀莖類藥用植物的快速繁殖提供技術(shù)參考。