本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種山慈菇栽培菌種及其制備工藝。

背景技術(shù)：

1、蘭科植物杜鵑蘭 cremastra?appendiculata(d.?don)makino>?加工藥材俗稱(chēng)毛慈菇，假鱗莖加工后入藥，藥材名稱(chēng)“山慈菇”具有味甘、微辛，性涼，具有清熱解毒、消癰散結(jié)等功效，常用于癰腫疔毒、瘰疬痰核、蛇蟲(chóng)咬傷、瘸瘕痞塊?，F(xiàn)代有文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，山慈菇提取物能夠抑制血管形成，此作用機(jī)制在抗腫瘤方面有較好的前景?，F(xiàn)代臨床用于治療肝硬化、食管賁門(mén)癌梗阻、宮頸癌等。山慈菇中豐富的多酚類(lèi)成分，特別是獨(dú)蒜蘭屬醇、聯(lián)芐類(lèi)成分如獨(dú)蒜蘭素c、d和獨(dú)蒜蘭醇，以及其他活性物質(zhì)，如杜鵑蘭素和感烷酮-3-醇類(lèi)，構(gòu)成了其強(qiáng)大的生物活性基礎(chǔ)。臨床應(yīng)用主要以消痰、解毒為主，還有抗腫瘤、降壓等作用廣泛用于治療多種疾病。制藥企業(yè)吸納作投料的用量日趨增長(zhǎng)，大型中醫(yī)院、民營(yíng)醫(yī)院藥用配方的用量也在增加中。產(chǎn)量逐年減少，用量逐年增加，供不應(yīng)求日益加劇。

2、山慈菇屬于蘭科植物，其種子極小、數(shù)量大，果莢內(nèi)有種子2萬(wàn)～3萬(wàn)粒。但無(wú)胚乳，自然界萌發(fā)率極低，野生資源有限，相應(yīng)市場(chǎng)需求旺盛，導(dǎo)致野生種群數(shù)量急劇減少。目前，山慈菇栽培菌種尚未發(fā)現(xiàn)公開(kāi)的菌種，主要繁殖技術(shù)僅限于兩種，第一種是山慈菇種子無(wú)菌萌發(fā)成苗后栽培；第二種是假鱗莖營(yíng)養(yǎng)繁殖。第一種因需要在無(wú)菌環(huán)境培育種苗，形成的種苗還需要煉苗后種植等程序，技術(shù)要求高、成本高、成活苗少，不宜大規(guī)模栽培；第二種栽培因?qū)儆跔I(yíng)養(yǎng)繁殖，每年每株才產(chǎn)生1個(gè)假鱗莖，繁殖效率極低。據(jù)了解，市場(chǎng)生產(chǎn)山慈菇菌種多處在試驗(yàn)階段，目前，生產(chǎn)多按傳統(tǒng)一級(jí)種、二級(jí)種、三級(jí)種的固體菌種生產(chǎn)模式，一級(jí)種生長(zhǎng)多在10～15天，二級(jí)種26～27天，三級(jí)種固體菌種生長(zhǎng)期在70～80天左右。拌料5～6個(gè)工/10000袋，滅菌2～3個(gè)工/10000袋，裝袋12～15個(gè)工/10000袋，接菌34～36個(gè)工/10000袋，存在用工量大、二級(jí)種生產(chǎn)需要塑料瓶成本增加、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等問(wèn)題。且傳統(tǒng)固體菌種因滅菌后袋口干失活占5%～6%，雜菌感染3%～4%，平均4%～5%，存在易感染、有失活現(xiàn)象等問(wèn)題，造成壞袋，增加了損失。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種接菌快且省工、省料的山慈菇栽培菌種的制備工藝，以及采用該工藝制備得到的山慈菇栽培菌種。

2、針對(duì)上述目的，本發(fā)明采用的山慈菇栽培菌種的制備工藝包括下述步驟：

3、步驟1：將液體培養(yǎng)基裝于錐形瓶中，高溫高壓滅菌后冷卻至室溫，接種輻毛小鬼傘（ coprinus?radians）n2，在搖床上培養(yǎng)至錐形瓶中培養(yǎng)液出現(xiàn)大量白色絮狀菌絲或者球狀菌球，靜置后培養(yǎng)液變得清澈，無(wú)明顯分層現(xiàn)象，且在無(wú)菌條件下通過(guò)顯微鏡觀察無(wú)細(xì)菌感染，作為液體菌種。

4、步驟2：將擴(kuò)大培養(yǎng)基裝于發(fā)酵罐中，高溫高壓滅菌后冷卻至室溫，將步驟1錐形瓶中的液體菌種倒入發(fā)酵罐的擴(kuò)大培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至發(fā)酵罐中出現(xiàn)大量白色絮狀菌絲或者球狀菌球，靜置后培養(yǎng)液變得清澈，無(wú)明顯分層或者漂浮物出現(xiàn)，通過(guò)排氣聞到無(wú)酸味或者臭味，且在無(wú)菌條件下通過(guò)顯微鏡觀察無(wú)細(xì)菌感染，作為二級(jí)液體菌種。

5、步驟3：將栽培基質(zhì)用裝袋機(jī)裝入耐高溫且無(wú)毒的塑料袋中，裝到至距離袋口3～6cm處，中心插入直徑2～3mm成型管，套上扣環(huán)，用耐高溫高壓蓋子封口后，高溫高壓滅菌后冷卻至室溫。

6、步驟4：將步驟3中冷卻至室溫的袋裝栽培基質(zhì)通過(guò)傳送帶送到接種室，在無(wú)菌環(huán)境下取下蓋子打開(kāi)塑料袋，拔出成型管，通過(guò)接種槍將步驟2發(fā)酵罐中的二級(jí)液體菌種從成型管形成的通道注入栽培基質(zhì)內(nèi)，再用蓋子封口。

7、步驟5：通過(guò)自動(dòng)傳送帶將步驟4中接好菌種的袋裝栽培基質(zhì)輸出接種室，裝筐送入溫度15～25℃、濕度50%～60%的環(huán)境室內(nèi)暗室培養(yǎng)，培養(yǎng)5～7天后上下倒筐，再繼續(xù)培養(yǎng)12～15天，獲得山慈菇栽培菌種。

8、上述步驟1中，所述液體培養(yǎng)基是按每1000ml純凈水加入土豆淀粉2.5～3.5g、黃豆粉1.5～2.5g、玉米粉0.8～1.2g、蛋白胨2.5～3.5g、一水葡萄糖15～25g、磷酸二氫鉀0.7～0.75g、硫酸鎂1.5～2.5g、酵母膏?2.5～3.5g配制而成，其ph為7.5～8。

9、上述步驟1中，所述高溫高壓滅菌的溫度為120～125℃、壓力為0.12～0.15mpa，滅菌時(shí)間為30～40min。

10、上述步驟1中，所述輻毛小鬼傘（ coprinus?radians）n2于2023年11月02日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no：40970。

11、進(jìn)一步，上述步驟1中，所述輻毛小鬼傘（ coprinus?radians）n2的接種量為液體培養(yǎng)基體積的2.5%～3%，在搖床上培養(yǎng)的溫度為20～25℃，培養(yǎng)時(shí)間為36～72小時(shí)。

12、上述步驟2中，所述擴(kuò)大培養(yǎng)基是按每200l純凈水加入土豆淀粉580～620g、黃豆粉580～620g、玉米粉180～220g、蛋白胨580～620g、一水葡萄糖3800～4200g、高純磷酸二氫鉀130～150g、硫酸鎂?380～420g、酵母膏580～620g配制而成，其ph為7.5～8。

13、上述步驟2中，所述高溫高壓滅菌的溫度為120～125℃、壓力為0.12～0.15mpa，滅菌時(shí)間為70～80min。

14、進(jìn)一步，上述步驟2中，所述液體菌種的加入量為擴(kuò)大培養(yǎng)基體積的0.3%～0.6%，所述擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為20～25℃，培養(yǎng)時(shí)間大于48～72小時(shí)。

15、上述步驟3中，所述栽培基質(zhì)是基質(zhì)與水質(zhì)量比1：1.1～1.5的混合物，其ph為6.5～7；所述基質(zhì)的質(zhì)量百分比組成為：木屑50%～60%、棉籽殼顆粒20%～28%、麩皮17%～20%、石膏1%～1.5%、白糖1%～1.5%、葡萄糖0.3%～0.6%。所述栽培基質(zhì)的制備方法為：按照栽培基質(zhì)的組成，將木屑、棉籽殼顆粒、麩皮、石膏拌勻，將白糖和葡萄糖用水溶解，然后將兩者混拌均勻。其中所述木屑的直徑為0.8～1.2cm。

16、上述步驟3中，所述高溫高壓滅菌的溫度為120～125℃、壓力為0.12～0.15mpa，滅菌時(shí)間為150～200min。

17、上述步驟3中，所述耐高溫且無(wú)毒的塑料袋為聚丙烯或者聚乙烯材質(zhì)的食用菌專(zhuān)用袋，所述耐高溫高壓蓋子為聚丙烯材質(zhì)含空氣過(guò)濾棉的蓋子。

18、上述步驟4中，所述二級(jí)液體菌種注入量為栽培基質(zhì)重量的0.01%～0.02%。

19、本發(fā)明的有益效果如下：

20、本發(fā)明利用輻毛小鬼傘（ coprinus?radians）n2為母種，經(jīng)錐形瓶中的液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)后在發(fā)酵罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得的二級(jí)液體菌種接入栽培基質(zhì)中于室內(nèi)養(yǎng)菌，獲得山慈菇栽培菌種。本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化栽培基質(zhì)配比和制備工藝，保證上下濕度均勻，菌種生長(zhǎng)好，種入地里傳菌快且持久，對(duì)山慈菇種子接菌、萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)芽、展葉期間的生長(zhǎng)關(guān)鍵環(huán)節(jié)提供了優(yōu)質(zhì)持久的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)；同時(shí)采用液體接菌制菌的方法，一級(jí)液體培養(yǎng)、二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后直接接菌培養(yǎng)，降低了轉(zhuǎn)接代數(shù)，菌種活力高、接菌快且省工、省料，雜菌感染率低，菌種易成活、生長(zhǎng)快。與傳統(tǒng)固體菌種相比，本發(fā)明工藝拌料2～3個(gè)工/10000袋，滅菌2～3個(gè)工/10000袋，裝袋12～15個(gè)工/10000袋，接菌11～18個(gè)工/10000袋，省工一半；在20～25℃，濕度50～60%條件下培養(yǎng)，比傳統(tǒng)菌種時(shí)間提前了40～50天。本發(fā)明方法培育的菌種，菌種營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)在90天以上，營(yíng)養(yǎng)豐富、供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，且栽培菌種失活為0%，雜菌感染0.3%～0.5%，平均0.3%～0.5%，損失降低10%，省工18～20個(gè)/10000袋/批次；在20～25℃，濕度50～60%條件下培養(yǎng)，比傳統(tǒng)固體菌種生長(zhǎng)時(shí)間縮短40～50天。