本發(fā)明涉及黨參繁殖，具體涉及一種黨參多倍體誘導及其高效人工育苗方法。

背景技術(shù)：

1、本節(jié)中的陳述僅提供與本技術(shù)公開相關(guān)的背景信息，并且可能不構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。

2、黨參codonopsis?pilosula(franch.)nannf.是桔梗科campanulaceae黨參屬codonopsis多年生草質(zhì)藤本植物，生于海拔1560-3100m的山地林邊及灌叢中。黨參被中國、日本和韓國等亞洲國家用于食品和民間醫(yī)學已有幾千年的歷史。黨參、素花黨參c.pilosula?nannf.var.modesta(nannf.)l.t.shen和川黨參c.tangshen?oliv的干燥根被《中國藥典》收錄，共同組成中藥黨參的基原植物；中醫(yī)傳統(tǒng)醫(yī)學認為這三種植物的干燥根具有健脾益肺，養(yǎng)血生津的功效，可以治療脾肺氣虛，咳嗽虛喘，氣血不足等病癥。黨參根中的皂苷、多糖、三萜、生物堿等多種次生代謝產(chǎn)物，使黨參具有多種藥理活性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗炎等功能。獨特的生物活性和無毒性使黨參在藥用和食用中頗受歡迎。因黨參生物活性與人參相似且價格便宜，黨參也常常被作為人參panax?ginsengc.a.mey.的替代品，《中國藥典》記錄了100多種含有黨參根或根提取物的中藥制劑。同時，黨參中還含有蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，經(jīng)常以保健品的形式出現(xiàn)在民間，尤其用來煲湯、制茶、煮粥和泡酒等。此外，黨參地上部分中的大量化學成分類型與地下部分相同，可以加工為飼料出售，且葉片中的抗氧化活性、蛋白質(zhì)、氨基酸、總黃酮和總多酚水平要高于地下部分。這種全草都具有商業(yè)價值的藥用植物，使黨參具有巨大的市場潛力。

3、多倍體對植物育種最重要的貢獻是細胞大小的增加(“gigas”效應)、有害突變的緩沖、雜合度的增加、以及雜種優(yōu)勢(雜交優(yōu)勢)的利用等。植物多倍體促進的這些變化使多倍體個體在極端環(huán)境中生存下來，并在競爭中可能勝過許多二倍體祖先；同時，這些變化也使人們對開發(fā)應用于植物育種目的的多倍體產(chǎn)生了越來越大的興趣；研究者們利用多倍體的這些特性選育出了產(chǎn)量較高、品質(zhì)較好的品種，增強了對生物和非生物脅迫的耐受性。對植物多倍體的研究至今已有100多年的歷史，發(fā)現(xiàn)多倍體在植物中是普遍存在的，且多倍體被普遍認為是一種常見的物種形成模式，對植物進化和生態(tài)學產(chǎn)生了極其深遠的影響。盡管如此，由于多倍體植株的數(shù)量有限，難以提供多倍體育種所需要的有著豐富遺傳背景的大量群體。為了解決這一問題，育種學家通常會選擇合適的材料，以人工誘導的手段來達到擴大多倍體植株基數(shù)的目的。秋水仙素誘導是人工誘導多倍體最常用的方法之一，其可阻礙細胞分裂中期紡錘絲的形成，使有絲分裂被迫中斷，但細胞和細胞質(zhì)并不分離，從而使染色體加倍。目前，人工誘導多倍體在植物方面已得到越來越廣泛的應用，如在麻瘋樹(jatropha?curcas?l.)、擬南芥(arabidopsis?thaliana(l.)heynh.)、尖瓜(trichosanthsdioica?roxb.)、玫瑰(rosa?rugosa?thunb.)、小麥(triticum?aestivum?l.)、紫錐菊(echinacea?purpurae?l.)等植物中都進行了多倍化嘗試。盡管多倍體存在著種子不育性增加和生長周期延長、開花延遲等不足和缺點，但人工誘導的多倍體依然被用于植物育種遺傳改良實驗，因為這種技術(shù)一方面通常會提高植物相關(guān)經(jīng)濟部分的生物量；另一方面，染色體的加倍明顯促進了次生代謝物的產(chǎn)生和增加，有助于目標植物增加商業(yè)價值，特別是能提高有效成分含量。

4、多倍體化方法主要有體外誘導體系和體內(nèi)誘導體系，最常用的方法是體外誘導，它可以在有限的空間里使多倍體植物快速發(fā)育。體外人工誘導多倍體依賴于組織培養(yǎng)技術(shù)，高效和可重復性是體外誘導的基礎。同時，外植體類型、外植體年齡、培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、添加劑等，會直接影響體外再生研究和基于體外的育種方法。目前，黨參倍性育種的研究較少，有學者利用黨參種子誘導了四倍體，并以胚軸為外植體誘導愈傷組織建立快繁體系，但誘導率和增殖系數(shù)并不理想；也有學者采用含有秋水仙堿的瓊脂凝膠涂抹黨參幼苗生長點的方法成功誘導了四倍體植株，但并沒有解決同源四倍體黨參大規(guī)模繁殖這一關(guān)鍵問題，但表明黨參同源四倍體植株較二倍體親本在葉片、莖、花器等方面具有顯著差異?；诖耍枰獙で笠环N新的成本低、時間短、質(zhì)量和成活率高，且能將多倍體性狀固定下來的無性繁殖方法來擴大黨參多倍體種苗的繁殖量，進行高品質(zhì)種苗的工廠化生產(chǎn)，以滿足種植需求。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于：針對目前黨參同源四倍體大規(guī)模繁殖難的問題，提供了一種黨參多倍體誘導及其高效人工育苗方法，通過多倍體誘導解決黨參藥用部位——根產(chǎn)量的大幅提高，并提供一種能夠提高多倍體植株快速繁殖效率的方法，該方法可為固定多倍體優(yōu)質(zhì)性狀、發(fā)展人工種植奠定技術(shù)基礎。通過本發(fā)明，可提供基因型背景一致的優(yōu)質(zhì)多倍體種苗以滿足人工種植的需求。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、一種黨參多倍體誘導及其高效人工育苗方法，包括如下步驟：

4、步驟(1)：外植體的獲?。哼x擇生長勢好、無病蟲害的健壯植株，取其幼嫩至少帶一個節(jié)、約1.0-1.5cm長的莖尖；

5、步驟(2)：外植體消毒接種預培養(yǎng)：將步驟(1)獲取的莖尖進行消毒處理，隨后接入培養(yǎng)基a中，控制光照度、溫度、光照時間進行預培養(yǎng)，帶節(jié)莖尖基部開始稍有膨大。

6、優(yōu)選地，培養(yǎng)基a包括以下原料：

7、ms基本培養(yǎng)液：

8、6-芐胺基嘌呤(6-ba)、激動素(kt)、α-萘乙酸(naa)、椰子汁、蔗糖和瓊脂粉。

9、步驟(3)：秋水仙素溶液浸泡處理：取步驟(2)基部開始稍有膨大的莖尖在經(jīng)高溫滅菌后(質(zhì)量比)為0.05％的秋水仙素溶液中浸泡處理12h；

10、步驟(4)：取步驟(3)中處理后的莖尖經(jīng)清洗后接種于添加0.05％秋水仙素的新鮮培養(yǎng)基a中，控制光照度、溫度、光照時間的條件下進行培養(yǎng)60-72h；

11、步驟(5)：取步驟(4)處理后的莖尖轉(zhuǎn)入新的不含秋水仙素的培養(yǎng)基a中，控制光照度、溫度、光照時間的條件下進行培養(yǎng)，獲得愈傷組織及不定叢芽；

12、步驟(6)：取步驟(5)誘導出的多倍體不定芽轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基b中進行單株擴繁建立單性系；

13、優(yōu)選地，所述多倍體不定芽為葉片較同期二倍體葉片肥大的不定芽。

14、優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基b，包括以下原材料：

15、ms基本培養(yǎng)液：

16、6-芐胺基嘌呤(6-ba)、激動素(kt)、α-萘乙酸(naa)、椰子汁、蔗糖和瓊脂粉。

17、步驟(7)：流式細胞儀初篩四倍體植株，將通過流式細胞儀初步鑒定的四倍體植株編號并將每一個單性系中的不定芽修剪后扦插于滅菌基質(zhì)中控制環(huán)境條件誘導生根；

18、優(yōu)選地，不定芽的修剪方式為：將每個芽剪為2-3cm、帶2個節(jié)。

19、優(yōu)選地，所述環(huán)境條件為溫度20-25℃，濕度在80-90％。

20、步驟(8)：對步驟(7)中的不定芽生成的根尖進行染色體制片二次鑒定四倍體植株；優(yōu)選地，二次鑒定四倍體植株具體為15d后隨機取20株，每株2個根尖，共40個根尖進行染色體制片；此步驟至少連續(xù)重復3代，以確保獲得的植株為純合四倍體；

21、步驟(9)：將步驟(8)鑒定的多倍體植株進行擴繁：將確定為多倍體的植株按編號對應瓶內(nèi)試管苗，轉(zhuǎn)新鮮培養(yǎng)基b中進行擴繁；

22、步驟(10)：將步驟(8)擴繁得到的叢生芽修剪后插入滅菌基質(zhì)中，無菌水噴濕基質(zhì)后控制環(huán)境條件為20-25℃，濕度在80-90％進行生根培養(yǎng)，30d后即可獲得苗壯根粗的生根苗。

23、優(yōu)選地，叢生芽的修剪方式為：將每個芽剪為2-3cm、帶2個節(jié)。

24、步驟(11)：移栽：將步驟(10)的生根苗進行自然條件下煉苗，每天太陽落山后輕噴100ml自來水，煉苗結(jié)束后移栽獲得定植苗。

25、優(yōu)選地，步驟(7)和步驟(10)的扦插可以是將修剪后的叢生芽輕輕插入于裝有經(jīng)高溫滅菌基質(zhì)的泡沫箱中，隨后在基質(zhì)表面輕噴無菌水，最后用透明保鮮膜將泡沫箱封口，置于陰涼有光的地方培養(yǎng)(光照強度)。泡沫箱內(nèi)溫度在20-25℃，濕度在80-90％左右，30d后即可獲得苗壯根粗的生根苗。泡沫箱內(nèi)徑長寬高可以為36×26×15cm。

26、優(yōu)選地，步驟(2)中外植體消毒的方法具體可以為：自來水洗凈表面后用質(zhì)量百分比10％洗衣粉溶液浸泡5min并輕微震蕩攪動后，流水沖洗30min，置于超凈工作臺上用體積百分比75％乙醇溶液處理5s，再用質(zhì)量百分比0.05％升汞水溶液滅菌8-10min，無菌水沖洗3次，每次不低于3min，在整個消毒過程中充分搖動器皿，最后將材料置于無菌吸水紙上，吸干其表面水分后用無菌手術(shù)刀將材料莖的傷口處切去0.2cm，按生理學方向垂直接入培養(yǎng)基a中。

27、優(yōu)選地，培養(yǎng)基a具體包括如下含量的各組分：1.0-1.5mg/l的6-芐胺基嘌呤(6-ba)、0.5-1.0mg/l的激動素(kt)、0.1-0.5mg/l的α-萘乙酸(naa)、50-60ml/l的椰子汁、30000mg/l的蔗糖和4700mg/l的瓊脂粉。

28、優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基a的ph值為5.4-5.8。

29、根據(jù)一種優(yōu)選的實施方式，所述步驟(3)中用于浸泡的莖尖為帶葉莖尖，所述帶葉莖尖的長度為1.0-1.5cm。

30、根據(jù)一種優(yōu)選的實施方式，所述步驟(4)中的莖尖的清洗為使用無菌水沖洗3次，每次不低于3min。

31、根據(jù)一種優(yōu)選的實施方式，所述步驟(4)中的培養(yǎng)周期為60-72h。

32、根據(jù)一種優(yōu)選的實施方式，培養(yǎng)基b，包括以下原料：1.5-2.5mg/l的6-芐胺基嘌呤(6-ba)、1.0-1.5mg/l的激動素(kt)、0.5-1.0mg/l的α-萘乙酸(naa)、50-60ml/l的椰子汁、30000mg/l的蔗糖和4700mg/l瓊脂粉。

33、本培養(yǎng)基培養(yǎng)能夠同時適應叢生芽誘導和增殖使用，并且均具有良好的誘導芽生成和增殖的效果，簡化實驗流程。

34、本培養(yǎng)基中的6-芐胺基嘌呤(6-ba)和α-萘乙酸(naa)的濃度配合，彼此協(xié)同能夠誘導出大量的愈傷組織并促進叢生芽的生長；同時椰子汁的加入，極大促進了叢生芽的產(chǎn)生，共同作用促進了叢生芽的生成和增殖。不設置椰子汁的培養(yǎng)基b中的愈傷組織僅產(chǎn)生愈傷組織膨大而無法產(chǎn)生大量叢生芽，因此難以實現(xiàn)叢生芽的誘導和增殖，不利于后續(xù)進程繼續(xù)進行。

35、優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基b的ph值為5.4-5.8。

36、進一步地，步驟(7)和(10)中所述基質(zhì)為泥炭土:珍珠巖＝3:1，滅菌溫度為125℃、時間25min；基質(zhì)厚度為4-6cm，用無菌水將基質(zhì)浸濕備用。

37、與現(xiàn)有的技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果是：

38、1、一種黨參多倍體誘導及其高效人工育苗方法，本發(fā)明采用秋水仙素浸泡和在愈傷組織和不定芽誘導培養(yǎng)基中加入的方式作用，誘導成功率較高(最高達23.59％)；在每一代中均做根尖壓片來確定四倍體而淘汰嵌合體，3代后可完全淘汰嵌合體。誘導得到了四倍體的黨參愈傷組織和叢生芽，隨后再基于組培的方式對叢生芽和愈傷組織進行擴繁，結(jié)合“微扦插”的方式控制環(huán)境條件成功誘導了培養(yǎng)的組培苗生根獲得了大量可以煉苗移栽的生根苗，繁殖系數(shù)達到41.15，實現(xiàn)了多倍體黨參植株的高效快速繁殖；

39、2、一種黨參多倍體誘導及其高效人工育苗方法，在多倍體誘導成功的基礎上，優(yōu)化了培養(yǎng)基配方，使得多倍體生長延緩的狀況緩解往常在相同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，多倍體瓶苗的生長周期往往是二倍體的1.5倍，而本技術(shù)中的多倍體植株的轉(zhuǎn)接周期可與二倍體植株的轉(zhuǎn)接周期幾乎相同；

40、3、一種黨參多倍體誘導及其高效人工育苗方法，本技術(shù)的離體誘導方式即組織培養(yǎng)誘變法容易控制實驗條件，由此可以確保獲得四倍體植株后，能夠人工進行單性系快速繁殖，證實了與活體誘導相比，本技術(shù)的離體誘導更具優(yōu)越性；

41、4、本發(fā)明將組織培養(yǎng)中的不定根誘導拓展到瓶外相對有菌條件下進行誘導，即瓶外“微扦插”技術(shù)，其生根率遠比瓶內(nèi)為高，且成活率高、生長量大。推測產(chǎn)生其效果的原因為：插條均為幼嫩不定芽，其內(nèi)源生長素水平相對較高，且瓶外基質(zhì)中擁有多種有益物質(zhì)和較好的透氣性；瓶外“微扦插”技術(shù)可為其他生根、移栽頑拗性品種提供借鑒；

42、5、多倍體特別是同源多倍體在染色體加倍后可帶來營養(yǎng)器官的巨大性變化，通過多倍體育種培育更為速生、優(yōu)質(zhì)的黨參品種，可縮短栽培利用周期，提高產(chǎn)業(yè)價值；由于多倍體的基因劑量倍增，使植物的一些生理生化過程隨之加強，新陳代謝旺盛，其體內(nèi)的某些生化成分的含量也相應提高。在黨參育種中，多倍體育種可望使利用組織代謝產(chǎn)物的相關(guān)品質(zhì)性狀得到改善提高，如皂苷等，從而提高其利用價值，降低生產(chǎn)成本；多倍體植株生活力強，對環(huán)境適應性和抗逆力很強。從植物地理分布上看，多倍體大多出現(xiàn)在高緯度、高海拔以及北極、沙漠等氣候環(huán)境變化劇烈的地區(qū)，進一步說明多倍體植株比通常的二倍體具有更強適應不利自然條件的能力；通過多倍體育種可提高黨參種苗的抗逆性，擴大其栽植范圍；

43、6、本發(fā)明用組織培養(yǎng)技術(shù)在培養(yǎng)室內(nèi)可實現(xiàn)周年生產(chǎn)，既節(jié)約了土地資源，又提高了經(jīng)濟效益，克服了傳統(tǒng)營養(yǎng)繁殖方式無法周年進行生產(chǎn)的難點；本發(fā)明實現(xiàn)了高效快繁的目的，40d為一個增殖培養(yǎng)周期，不僅解決了多倍體植株繁殖困難的問題，且在較短的時間內(nèi)獲得了極高的增殖系數(shù)，其效益可觀；

44、7、本發(fā)明僅需一株確定加倍成功的多倍體植株，便可在同一培養(yǎng)基中利用直接器官發(fā)生方式完成增殖和生根過程，既可在滿足大規(guī)模生產(chǎn)需要的同時，又保持了多倍體的優(yōu)良性狀，為其人工快繁最有效的增殖方式，且提高了種苗質(zhì)量；

45、8、本發(fā)明簡化了培養(yǎng)程序，在多倍體誘導成功后，整個快速繁殖過程只需1種培養(yǎng)基就解決了完成了愈傷組織-不定叢芽-愈傷組織-不定叢芽的循環(huán)過程，利于安排生產(chǎn)計劃；

46、9、本發(fā)明將不定根誘導和馴化有機地結(jié)合在一起，體外“微扦插”的實施，使贏弱的叢生苗復壯、生根和馴化達到一體化，不但極大地縮短育苗周期，并且解決了在黨參中一直困擾育種工作者組培苗馴化死亡率高的問題；體外“微扦插”使幼苗移栽成活率高，且生長迅速；目前在已進行示范栽培，效果很好；

47、10、本發(fā)明對黨參種質(zhì)改良和快速繁殖具有重要意義和價值，同時也可為其他多年生草本類藥用植物的離體加倍和快速繁殖提供技術(shù)參考。