一種用于西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基及利用該培養(yǎng)基誘導(dǎo)西瓜花藥愈傷組織的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)方法和用于誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，具體涉及一種用于 西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基及利用該培養(yǎng)基誘導(dǎo)西瓜花藥愈傷組織的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 花藥培養(yǎng)是獲得單倍體的有效途徑。目前，通過花藥培養(yǎng)獲得高配子胚胎發(fā)生的 作物，主要在谷物、十字花科和一些茄科類作物上?；ㄋ幣囵B(yǎng)誘導(dǎo)單倍體受很多因素的影 響，如：誘導(dǎo)培養(yǎng)基，小孢子發(fā)育時(shí)期，前期處理，培養(yǎng)條件，供體植株生長(zhǎng)狀態(tài)，基因型等。 早在1981年，薛光榮等在西瓜品種"瓊酥"上，成功誘導(dǎo)出花粉植株，隨后又在"周至紅"西 瓜品種上，獲得了花粉植株，但其愈傷組織誘導(dǎo)率及分化頻率均較低，在育種上難以利用， 沒有得到推廣；袁萬良"YUAN Wanliang，F(xiàn)U Ruiming，LEI Baolin. The preliminary report of watermelon anther culture[J] ? Shanxi Agricultural Sciences,1995, (1):29-30. 袁萬良，付潤(rùn)民，雷保林等.西瓜花培試驗(yàn)初報(bào)[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1995,（1) :29-30."、 魏瑰"WEI Ying. The effects of low-temperature pretreatment on anther callus induction [J]. Agricultural Science and Technology, 1999，（9): 34-36?魏瑰?低溫預(yù) 處理對(duì)西瓜花藥誘導(dǎo)愈傷組織的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技，1999,（9) :34-36. "等研宄，使西 瓜花藥培養(yǎng)的愈傷組織誘導(dǎo)率有所提高，但沒有后續(xù)報(bào)道，對(duì)愈傷組織的質(zhì)量也無明確說 明；緱艷霞''[GOU Yanxia. The technology research of watermelon anther culture [D]. Hangzhou，Zhejiang University，2006.緱艷霞.西瓜花藥離體培養(yǎng)技術(shù)研宄[D].杭州： 浙江大學(xué)，2006. "李娟"[13] LI Juan. The study of watermelon anther and microspore culture [D].Yaan, Sichuan Agricultural University, 2006?李娟?西瓜花藥和小抱子培 養(yǎng)研宄[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008. "等對(duì)西瓜花藥和小孢子培養(yǎng)進(jìn)行了研宄，但未取 得顯著成效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng) 基及利用該培養(yǎng)基誘導(dǎo)西瓜花藥愈傷組織的方法，提出了一種適宜的西瓜花藥有效愈傷組 織誘導(dǎo)方法，為西瓜花藥培養(yǎng)再生技術(shù)體系的建立奠定基礎(chǔ)。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種用于西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基是 在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加NAA、6-BA、KT和Gln，所述NAA、6-BA、KT和Gin的濃度分別為 0? 2-1. Omg ? L \2. Omg ? L ^l. Omg ? L 1和 40_100mg ? L 丄。
[0005] 本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)包括：
[0006] 培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加NAA、6-BA、KT和Gln，所述NAA、6-BA、KT和 Gin 的濃度分別為 1. Omg ? L i、2. Omg ? L Omg ? L 1和 100mg ? L 工。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述的培養(yǎng)基誘導(dǎo)西瓜花藥愈傷組織的方 法，包括以下步驟：取單核靠邊期花蕾，低溫處理2d-3d，接種于所述培養(yǎng)基上，高溫預(yù)培養(yǎng) 2-3d〇
[0008] 所述的單核靠邊期花蕾選取時(shí)間為晴天早上6 :00-8:00。
[0009] 所述的單核靠邊期花蕾選自5-6月份花蕾縱徑2-4mm，橫徑3-4mm，萼片緊貼花瓣， 花瓣閉合，呈深綠色，花藥顏色呈淡黃色至黃綠色。
[0010] 所述的低溫處理包括：取花蕾，用自來水沖洗3次，再用濕紗布包裹好，置于4°C下 處理，然后，在無菌操作臺(tái)上，將預(yù)處理后的花蕾投到75%的酒精中消毒30s，再用0. 1%的 HgCl2消毒8分鐘，最后用無菌水沖洗3-5次；消毒完成后，把無菌的花蕾用無菌的刀子鑷子 剝開，取出花藥，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
[0011] 所述的高溫預(yù)培養(yǎng)包括：把接種后的花藥分別放入35°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2d。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種上述的培養(yǎng)基在西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)中的應(yīng)用。
[0013] 所述的應(yīng)用中的西瓜是HJ001、西農(nóng)8號(hào)和大果黑美人。
[0014] 本發(fā)明以"HJ001"（雜交種）、西農(nóng)8號(hào)、大果黑美人為試驗(yàn)材料，分別進(jìn)行不同低 溫預(yù)處理時(shí)間、不同高溫預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、植株生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、不同附加物、不同基因型、不同生長(zhǎng) 環(huán)境和取材時(shí)期對(duì)西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響，統(tǒng)計(jì)不同處理的有效愈傷組織誘導(dǎo)率和 無效組織誘導(dǎo)率。經(jīng)4°C低溫處理2d-3d，有效愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到18.33%;高溫預(yù)培養(yǎng) 2d-3d，有效愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到14% ;NAA的誘導(dǎo)效果較2,4-D好；在培養(yǎng)基上添加谷氨酰 胺（Gin) 100mg噸―1有效愈傷組織誘導(dǎo)率分別達(dá)到19. 00%和20. 33%;在5月下旬6月初， 采集的花蕾活力較高，花蕾縱徑2-4mm，橫徑3-4mm，萼片緊貼花瓣，花瓣閉合，呈深綠色，花 藥顏色呈淡黃色至黃綠色時(shí)多為小孢子單核靠邊期，不同品種間稍有差異；3個(gè)品種的有 效愈傷組織誘導(dǎo)率和總愈傷組織誘導(dǎo)率有較大差異，差異最大達(dá)到16%和46. 34%。在晴 天早上6:00-8:00，取單核靠邊期花蕾，低溫處理2(1-3(1，接種在]^+隱41.011^，17 1+6-842.0111 g ? L-i+KTl. Omg ? P+GLN 100mg ? L-1高溫預(yù)培養(yǎng)2d-3d，有效愈傷組織誘導(dǎo)率最高。
【附圖說明】
[0015] 圖1是小孢子活力檢測(cè)結(jié)果圖。
[0016] 圖2是小孢子單核期鏡檢圖。
[0017] 圖3是低溫處理時(shí)間對(duì)西瓜有效愈傷組織誘導(dǎo)率的影響結(jié)果圖。
[0018] 圖4是低溫處理時(shí)間對(duì)西瓜無效愈傷組織誘導(dǎo)率的影響結(jié)果圖。
[0019] 圖5是高溫處理時(shí)間對(duì)西瓜有效愈傷組織誘導(dǎo)率的影響結(jié)果圖。
[0020] 圖6是高溫處理時(shí)間對(duì)西瓜無效愈傷組織誘導(dǎo)率的影響結(jié)果圖。
[0021] 圖7是白色、棉絮狀愈傷組織。
[0022] 圖9是質(zhì)地堅(jiān)硬緊密的愈傷組織。
[0023] 圖8是黃色質(zhì)地疏松的愈傷組織。
[0024] 圖10是質(zhì)地堅(jiān)硬緊密的愈傷組織。
[0025] 圖11是不同濃度附加物對(duì)于西瓜愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。
[0026] 圖12是不同生長(zhǎng)季節(jié)對(duì)西瓜有效愈傷組織誘導(dǎo)率的影響結(jié)果圖。
[0027] 圖13是不同生長(zhǎng)季節(jié)對(duì)西瓜無效愈傷組織誘導(dǎo)率的影響結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明。
[0029] 本發(fā)明一種用于西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的 基礎(chǔ)上添加NAA、6-BA、KT和GLN，所述NAA、6-BA、KT和GLN的濃度分別為0. 2-1.Omg?L' 2.Omg?L-1、1.Omg?L-1和40-100mg?L―1。作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述培養(yǎng)基是在MS培 養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加NAA、6-BA、KT和GLN，所述NAA、6-BA、KT和GLN的濃度分別為1.Omg噸' 2.Omg?L'I.Omg?L1和 100mg?L、
[0030] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述的培養(yǎng)基誘導(dǎo)西瓜花藥愈傷組織的方 法，包括以下步驟：取單核靠邊期花蕾，低溫處理2d-3d，接種于所述培養(yǎng)基上，高溫預(yù)培養(yǎng) 2-3d〇
[0031] 所述的單核靠邊期花蕾選取時(shí)間為晴天早上6 :00-8:00。所述的單核靠邊期花蕾 選自5-6月份花蕾縱徑2-4mm，橫徑3-4mm，萼片緊貼花瓣，花瓣閉合，呈深綠色，花藥顏色呈 淡黃色至黃綠色。
[0032] 所述的低溫處理包括：取花蕾，用自來水沖洗3次，再用濕紗布包裹好，置于4°C下 處理，然后，在無菌操作臺(tái)上，將預(yù)處理后的花蕾投到75%的酒精中消毒30s，再用0. 1%的 HgCl2消毒8分鐘，最后用無菌水沖洗3-5次；消毒完成后，把無菌的花蕾用無菌的刀子鑷子