一種基于玉米幼胚的形態(tài)鑒別單倍體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設及一種基于玉米幼胚形態(tài)鑒別單倍體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米是我國種植面積第一大作物，2012年，玉米播種面積超過％00萬hm2。我國 97% W上的玉米播種面積使用雜交玉米化i J，2009)。優(yōu)良玉米自交系的選育是玉米利用 雜種優(yōu)勢、選育優(yōu)良雜交種的基礎和關(guān)鍵。但傳統(tǒng)選育方法需要7~8個世代才能獲得較為 穩(wěn)定的自交系，而單倍體育種技術(shù)只需2個世代(Weber D F，2014)。因此，單倍體育種技術(shù) 作為一種快速獲得純系的方法已經(jīng)被國內(nèi)外許多種業(yè)公司規(guī)?；瘧?，成為可與轉(zhuǎn)基因技 術(shù)、分子標記輔助育種技術(shù)相媳美的現(xiàn)代化玉米育種=大核屯、技術(shù)之一(陳紹江等，2009)。
[0003] 隨著單倍體育種技術(shù)的大規(guī)模應用，進一步提高其效率及工程化顯得極為重要。 單倍體技術(shù)流程可W劃分為W下4個環(huán)節(jié):①單倍體的產(chǎn)生;②單倍體的鑒別;③單倍體的 加倍;④DH系的利用。其中，單倍體的誘導對DH系（doubled haploid,DH)的產(chǎn)生至關(guān)重要， 決定著單倍體獲得的數(shù)量。單倍體的鑒別是單倍體育種技術(shù)工程化的重要環(huán)節(jié)，其鑒別的 準確率、速率直接影響單倍體育種技術(shù)的規(guī)?；瘧?。
[0004] 通過組培途徑進行DH系的工廠化生產(chǎn)是實現(xiàn)單倍體工程化育種的又一重要方式。 現(xiàn)有單倍體的鑒別方法如包括根尖壓片染色體計數(shù)、細胞流式儀分析核酸含量、SSR和SNP 分子標記檢測、Rl-nj顏色標記、巧粒油分標記、巧粒重量等（Antoine-Michard S and Becke;rt 1,1997;陳紹江等，2003;Ba;rret P et al,2008;Melchinger A E et al,2013;Xu X et al,2013;Barton J E et al,2014;Smelser A et al,2015)。運些方法主要是對巧粒 和植株效果較好，但在組培條件下，如何實現(xiàn)單倍體的快速準確選擇尚無高效方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種鑒別或輔助鑒別玉米單倍體幼胚的方法。
[0006] 本發(fā)明提供的鑒別或輔助鑒別玉米單倍體幼胚的方法為如下1)或2)或3):
[0007] 1)用玉米單倍體誘導系作為父本給母本授粉，授粉后取幼穗進行剝胚，得到玉米 幼胚;將所述玉米幼胚按照寬度由小到大的順序進行排序，選擇排序為前20-30%的玉米幼 胚，得到或候選得到玉米單倍體幼胚；
[000引2)用玉米單倍體誘導系作為父本給母本授粉，授粉后取幼穗進行剝胚，得到玉米 幼胚;將所述玉米幼胚按照面積由小到大的順序進行排序，選擇排序為前20-30%的玉米幼 胚，得到或候選得到玉米單倍體幼胚；
[0009] 3)用玉米單倍體誘導系作為父本給母本授粉，授粉后取幼穗進行剝胚，得到玉米 幼胚;將所述玉米幼胚按照長度由小到大的順序進行排序，選擇排序為前20-30%的玉米幼 胚，得到或候選得到玉米單倍體幼胚。
[0010] 上述方法中，所述選擇排序為前30 %的玉米幼胚。
[0011] 上述方法中，所述玉米幼胚長度為2.0~7.0mm。
[0012] 上述方法中，所述玉米單倍體誘導系為農(nóng)大高誘5號或農(nóng)大高油高誘3號;所述母 本為玉米自交系或玉米雜交種。
[0013] 上述方法中，所述玉米自交系為B73或Mol7;所述玉米雜交種為鄭單958或B73/ Mol7；
[0014] 所述B73/M017是WB73為母本，Mol7為父本的雜交子代。
[0015] 上述方法中，所述玉米幼胚的數(shù)量為86-1734;所述玉米幼胚的數(shù)量具體為86、 189、428、335、411、474、1642或17：34。
[0016] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述方法的新用途。
[0017] 本發(fā)明提供了上述方法在培育玉米單倍體植株中的應用。
[0018] 本發(fā)明的最后一個目的是提供一種培育玉米單倍體植株的方法。
[0019] 本發(fā)明提供的培育玉米單倍體植株的方法包括如下步驟，
[0020] 1)用玉米單倍體誘導系作為父本給母本授粉，授粉后取幼穗進行剝胚，得到玉米 幼胚;將所述玉米幼胚按照長度或?qū)挾然蛎娣e由小到大的順序進行排序，選擇排序為前so-so % 的玉米幼胚， 得到或候選得到玉米單倍體幼胚；
[0021 ] 2)將所述玉米單倍體幼胚在加倍培養(yǎng)基上進行加倍，培養(yǎng)，根據(jù)株型和/或莖桿顏 色選取玉米單倍體植株。
[0022] 通過實驗證明：本發(fā)明的方法在玉米幼胚時期即可實現(xiàn)對單倍體的挑選，在幼胚 顏色表達之前將很大一部分雜合的二倍體幼胚淘汰掉，提前了單倍體挑選的時間，提高挑 選的效率，進一步縮短了育種時間，也節(jié)省了后續(xù)的成本，提高了經(jīng)濟效益。且本發(fā)明提供 的方法具有自動化挑選單倍體的前景，加速了玉米單倍體工程化育種的進程。
【附圖說明】
[0023] 圖1為單倍體幼胚的照片。其中，紅色箭頭所指的為單倍體幼胚。
【具體實施方式】
[0024] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0025] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0026] 玉米單倍體誘導系農(nóng)大高誘5號(CAU5)為下述實施例中的父本，在文獻"Dong, X.， et al.(2014)."Marker-assisted selection and evaluation of high oil in vivo haploid inducers in maize. "Molecular Breeding 34(3): 1147-1158." 中公開過，公眾 可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得。
[0027] 玉米(Zea mays L.)雜交種鄭單958是北京思農(nóng)種業(yè)有限公司的產(chǎn)品，執(zhí)行標準： GB4404.1-2008。
[0028] 玉米單倍體誘導系農(nóng)大高油高誘3號（C冊13)為下述實施例中的父本，在文獻"董 昕，2014,玉米單倍體誘導基因姐irl精細定位與新型誘導系選育研究，博±論文"中公開 過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得。
[00巧]玉米自交系B73和Mol7為下述實施例中的母本，在文獻"Lee M,化aropova N, Beavis W D,et al.Expanding the genetic map of maize with the intermated B73X Mol7(IBM)population[J] .Plant molecular biology,2002,48(5-6) :453-461."中公開 過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得。
[0030] MS鹽是上海宇涵生物科技有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為140225。
[0031] B73/M017是WB73為母本，Mol7為父本雜交得到的Fl代個體，在文獻"Lee M， Sharopova N,Beavis W D,et al.Expanding the genetic map of maize with the intermated B73XMol7(IBM)population[J].Plant molecular biology,2002,48(5-6): 453-461."中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得。
[0032] 實施例1、一種基于玉米幼胚形態(tài)鑒別單倍體的方法
[0033] -、單倍體幼胚的鑒別方法
[0034] 1、雜交
[0035] (1)雜交親本
[0036] WB73為母本，W誘導系CAU5為父本，雜交，得到雜交子代A;
[0037] WMol7為母本，W誘導系CAU5為父本，雜交，得到雜交子代B;
[0038] WB73為母本，W誘導系C冊13為父本，雜交，得到雜交子代C;
[0039] WMo