本發(fā)明屬于食品加工領(lǐng)域，涉及酶解蜂王漿的制備方法，還涉及由該方法制得的產(chǎn)品和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國(guó)上糖尿病發(fā)病人群逐年增高，糖尿病發(fā)病最重要的因素是人們體內(nèi)的胰島素分泌不足。雖然西藥目前是治療糖尿病最好的手段，但是也有一些限制性和副作用，如會(huì)引發(fā)血糖偏低和機(jī)體酸中毒的癥狀，而且糖尿病患者會(huì)存在一些長(zhǎng)期使用藥物治療而無(wú)療效的并發(fā)癥，在完全治療和防治等方面還缺乏特效的手段和藥品。目前，糖尿病飲食療法是當(dāng)前糖尿病無(wú)法根治階段食療的研究和應(yīng)用方向。其中用蜂王漿來(lái)進(jìn)行糖尿病的預(yù)防和治療，取得了一定的效果。新鮮蜂王漿含有蛋白質(zhì)12％-15％、脂質(zhì)3％-6％、糖類10％-16％，其他的維生素、氨基酸及礦物質(zhì)占2％-3％。其中，蛋白質(zhì)在蜂王漿的干物質(zhì)中含量最高，約30％-50％，并含有高生物活性的酶及多肽。然而，極差的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及酸澀辛辣的不良口感是制約蜂王漿產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。因此，在新鮮蜂王漿營(yíng)養(yǎng)保健功能的基礎(chǔ)上，通過(guò)酶解技術(shù)，改善蜂王漿的理化特性及感官指標(biāo)，對(duì)蜂王漿的深度開(kāi)發(fā)及利用具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種酶解蜂王漿的制備方法，該方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和；本發(fā)明的目的之二在于提供由上述方法制得的酶解蜂王漿；本發(fā)明的目的之三在于提供酶解蜂王漿的應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

酶解蜂王漿的制備方法，包括如下步驟：

(1)制備蜂王漿水溶液：取新鮮蜂王漿，加水溶解，制得蜂王漿水溶液；

(2)酶解：將步驟(1)制備得的蜂王漿水溶液加入氯化鈣，然后調(diào)節(jié)蜂王漿溶液ph＝7.5，再加入蛋白酶k，酶解，反應(yīng)結(jié)束滅酶，得酶解蜂王漿。

本發(fā)明步驟(1)中，蜂王漿與水的料液比為1：9。

本發(fā)明步驟(2)中，所述氯化鈣加入量為加入后氯化鈣終濃度為0.1mol/l。

本發(fā)明步驟(2)中，調(diào)節(jié)蜂王漿溶液ph用1mol/l的naoh調(diào)節(jié)。

本發(fā)明步驟(2)中，蛋白酶k加入量按加入后蛋白酶k終濃度為60ug/ml。

本發(fā)明步驟(2)中，所述酶解液在55℃溫度下攪拌反應(yīng)4h。

本發(fā)明步驟(2)中，所述滅酶為100℃下加熱5min。

2.由所述的制備方法制得的酶解蜂王漿。

3.所述酶解蜂王漿在制備降糖的食品或保健品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開(kāi)了酶解蜂王漿的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用，該方法使用蛋白酶k進(jìn)行酶解，蛋白酶k屬于絲氨酸蛋白酶類，是通過(guò)林伯氏白色念球菌(tritirachiumalbumlimber)生產(chǎn)的一類蛋白酶，主要應(yīng)用于分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)生化試驗(yàn)，在提取組織dna及rna的過(guò)程中具有十分重要的作用。相比于傳統(tǒng)酶解改性技術(shù)使用的酶類，蛋白酶k通過(guò)白色念球菌進(jìn)行生產(chǎn)，具有統(tǒng)一的生產(chǎn)規(guī)格、穩(wěn)定的水解活性及成熟的反應(yīng)條件及反應(yīng)體系，而氯化鈣作為蛋白酶k的穩(wěn)定劑也能在蜂王漿產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用中同時(shí)使用，以獲得富含鈣離子的高附加值產(chǎn)品。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，條件溫和，制得的酶解蜂王漿降糖效果優(yōu)于未經(jīng)處理的蜂王漿，對(duì)蜂王漿制品開(kāi)發(fā)及其醫(yī)療保健開(kāi)發(fā)具有重要意義。

具體實(shí)施方式

下面將對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

本發(fā)明實(shí)施例使用的試劑如下：四氧嘧啶(華中海威)；血糖檢驗(yàn)試紙，尿糖檢驗(yàn)試紙(三諾生物)；生理鹽水；清潔級(jí)小鼠(11-40g)(重慶市畜牧科學(xué)院)；蛋白酶k(merck，40u/mg)；氯化鈣；蒸餾水；氫氧化鈉；鹽酸；蜂王漿(重慶佳聯(lián)生物技術(shù)有限公司)；pbs磷酸緩沖液配置：8.150g/lnacl、0.201g/lkcl、1.420g/lna2hpo4、0.239g/lkh2po4；bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒(tiangen)。

實(shí)施例1、酶解蜂王漿的制備方法

(1)制備蜂王漿水溶液：稱取25g蜂王漿，加入225ml蒸餾水溶解，料液比(質(zhì)量體積比，單位：g/ml)為1:9，攪拌混勻，制得蜂王漿水溶液；

(2)酶解：將步驟(1)制備好的蜂王漿水溶液加入氯化鈣2.775g(終濃度為0.1mol/l)，然后使用1mol/l的naoh調(diào)節(jié)蜂王漿溶液至ph＝7.5，然后加入蛋白酶k15mg(60μg/ml)，在55℃溫度下攪拌反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后于100℃下加熱5min滅酶，得酶解蜂王漿。

將步驟(2)制得的酶解蜂王漿分別按10.00、5.00、2.5g/kg3個(gè)濃度梯度配制，備用。

實(shí)施例2、糖尿病小鼠造模

隨機(jī)選取不同體重的健康小鼠150只，于標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼養(yǎng)條件下正常飼養(yǎng)3d，第3日起禁食16h，然后測(cè)定體重、血糖空腹值和尿糖的陰陽(yáng)性指標(biāo)，挑選126只血糖低于9mmol/l，且尿糖陰性的雌雄各半小鼠，分別按照雌性小鼠不同體重(22-26g、18-21.9g、14-17.9g)隨機(jī)分成高、中、低劑量組9組，雄性小鼠不同體重(22-26g、18-21.9g、14-17.9g)隨機(jī)分成高、中、低劑量組9組并于標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼養(yǎng)條件下正常飼養(yǎng)備用。

四氧嘧啶劑量分組：首先設(shè)置出高、中、低四氧嘧啶劑量組，然后再分別對(duì)不同性別、體重的小鼠按照200mg/kg、120mg/kg和50mg/kg的劑量組來(lái)對(duì)小鼠進(jìn)行不同劑量的四氧嘧啶分組，分組后小鼠禁食不禁水16小時(shí)，然后按設(shè)定劑量給予腹腔注射四氧嘧啶，72h后又采血，使用血糖檢驗(yàn)試紙和血糖儀測(cè)定血糖，同時(shí)測(cè)定尿糖(鼠尿可采取尿濕墊料加水浸泡離心液代替)。以試紙和血糖儀測(cè)得血糖濃度大于15mmol/l、且尿糖為++以上的小鼠指標(biāo)為造模成功的指標(biāo)。

結(jié)果顯示，造模后3d內(nèi)，共有37只小鼠死亡。造模后第3天空腹血糖值>15mmol/l的小鼠出現(xiàn)明顯的三多一高癥狀(多飲、多食、多尿、血糖增高)、呆滯、皮毛松散、尿糖陽(yáng)性、拒食和體重減輕等癥狀。部分小鼠在實(shí)驗(yàn)后不久皮溫降低2-3℃，并在不同時(shí)期死亡，其結(jié)果見(jiàn)表1、表2、表3和表4。

表1、雄性小鼠分組的造模成功率和死亡率

表2、雌性小鼠分組的造模成功率和死亡率

表3、造模雄性小鼠的空腹血糖值和尿糖穩(wěn)定性(均值，mmol/l)

表4、造模雌性小鼠的空腹血糖值和尿糖穩(wěn)定性(均值，mmol/l)

注：成功率＝造模成功小鼠數(shù)量÷成活小鼠數(shù)量×100％；死亡率＝死亡小鼠數(shù)量÷注射小鼠數(shù)量×100％

表1、表2、表3和表4結(jié)果顯示，雄性18-21.9g體重高、中劑量組小鼠成模率為100％，低劑量組成模率只有42.86％；最高劑量組的死亡率42.86％，中劑量組的死亡率14.29％，低劑量組的死亡率0％。雌性18-21.9g體重高、中劑量組小鼠成模率為100％，低劑量組成模率只有33.33％；高劑量組死亡率為57.14％，中劑量組死亡率為28.57％，低劑量組死亡率為14.29％。腹腔注射四氧嘧啶途徑可以成功造出小鼠糖尿病模型，并且選擇體重18-21.9g的雄性小鼠禁食16h，120mg/kg四氧嘧啶腹腔注射，可獲得低死亡率、高成模率、持續(xù)穩(wěn)定的小鼠糖尿病模型。

將糖尿病小鼠用標(biāo)準(zhǔn)小鼠的飼養(yǎng)條件進(jìn)行喂養(yǎng)，第一次在一個(gè)星期以后按照上述方法進(jìn)行血糖和尿糖的測(cè)定，并記錄變化，第二次則是在兩個(gè)星期以后同樣進(jìn)行此步驟分析糖尿病模型的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示在十天內(nèi)，低劑量組可以保持高水平的尿糖和血糖值，但是在二十天后會(huì)逐漸降低，有些直接降低到了最低水平(9mmol/l)而導(dǎo)致最終不能成模。但是，高劑量組和中劑量組在二十天以內(nèi)的血糖和尿糖值都比較穩(wěn)定，波動(dòng)范圍比較小，且一直保持在較高的水平上，相比低劑量組，高、中劑量組的模型穩(wěn)定性較優(yōu)。

實(shí)施例3、酶解蜂王漿降糖試驗(yàn)

在成模小鼠中選擇出56只小鼠進(jìn)行分組，另選8只雄性正常小鼠做陰性對(duì)照組，然后按以下方法處理：

a酶解蜂王漿組(高中低組)

造模成功后，分別按10.00、5.00、2.5g/kg灌胃實(shí)施例1制得的蜂王漿酶解液，連續(xù)15天；

b蜂王漿組(高中低組)

造模成功后，分別按10.00、5.00、2.5g/kg灌胃蜂王漿，連續(xù)15天；

c陽(yáng)性對(duì)照組

只注射四氧嘧啶，測(cè)血糖，連續(xù)15天；

d陰性對(duì)照組

不做任何處理，只測(cè)血糖，連續(xù)15天；

最后一次給藥前需對(duì)小鼠絕食6個(gè)小時(shí)，并在灌喂酶解蜂王漿后的1、3、5h后分別測(cè)定一次血糖水平。尾靜脈采血測(cè)定的小鼠血糖值，采用spss19.0軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果如表5所示。

表5、酶解蜂王漿防治四氧嘧啶引起小鼠高血糖效果(均值，mmol/l)

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列不同小寫字母表示差異顯著(p＜0.05)。

結(jié)果顯示，蜂王漿和酶解蜂王漿均有不同程度的降糖效果；蜂王漿和酶解蜂王漿的降糖效果隨著劑量的增加而顯著提高；酶解蜂王漿的降糖效果優(yōu)于未經(jīng)處理的蜂王漿，尤其是高中劑量的酶解蜂王漿。表明酶解蜂王漿對(duì)四氧嘧啶引起小鼠高血糖有一定的治療效果，尤以高劑量組效果較好。

最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。