本發(fā)明涉及納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體是具有腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶向功能的氫氧化釓納米棒的制備方法。

背景技術(shù)：

腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)腫瘤中最常見的一種，約占顱內(nèi)腫瘤的32% ~ 61%，目前神經(jīng)膠質(zhì)瘤仍然缺乏有效的治療方法，總體預(yù)后差，且由于惡性腫瘤的局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移特性而易復(fù)發(fā)。腫瘤的治療效果和治療費(fèi)用與病癥的發(fā)現(xiàn)時(shí)期密切相關(guān)，因此腫瘤的早期診斷是治療的關(guān)鍵。分子影像學(xué)是在活體狀態(tài)下對(duì)生物在細(xì)胞和分子水平進(jìn)行定性和定量分析，其可在腫瘤早期還未出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)檢測到病變分子生物學(xué)特性，如癌前分子改變、基因變化等腫瘤標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期檢測與治療。目前最為常用的分子影像學(xué)技術(shù)有X-射線斷層成像、磁共振成像（MRI）、正電子發(fā)射斷層成像和單光子發(fā)射斷層成像、激發(fā)熒光斷層成像和生物發(fā)光斷層成像。為達(dá)到與體內(nèi)組織反襯的效果，這些醫(yī)學(xué)成像技術(shù)通常需要適當(dāng)?shù)募{米顆粒作為造影劑輔助腫瘤的早期診斷。其中MRI已廣泛應(yīng)用于人體多種疾病的檢測與早期診斷，它擁有許多其他影像學(xué)檢測方法不具備的優(yōu)勢(shì)，如較強(qiáng)的軟組織分辨能力，可以任意方位成像且有較高的時(shí)間分辨率和空間分辨率，不會(huì)引起放射性損傷。MRI造影劑可通過引起鄰近組織弛豫時(shí)間變化而產(chǎn)生影像增強(qiáng)效果，是應(yīng)用于診斷的復(fù)合物。目前，MRI常用的釓離子Gd³⁺螯合物陽性造影劑易被體內(nèi)清除及引起腎源性纖維化，因此開發(fā)生物相容性好、體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長并且容易體內(nèi)降解的釓基增強(qiáng)造影劑就顯得非常重要。氫氧化釓（Gd(OH)₃）由于其生物相容性好、易體內(nèi)降解、且有很高的r₁弛豫率而越來越引起研究者重視。

制備氫氧化釓納米材料的方法較多，主要有直接水熱法、氧化釓水熱法兩種。Yin等人(Chinese Chemical Letter 2007, 18, p491)采用氧化釓水熱法制備長度約500納米的氫氧化釓納米棒；Huang等人(New Journal of Chemistry, 2012, 36, p1335)采用直接水熱法制備了具有較好生物相容性、尺寸分布較寬、平均長度為100納米的氫氧化釓納米棒。然而這些一步法的制備工藝雖然簡單，但得到納米棒材料的尺寸分布寬，其T₁影像增強(qiáng)率低，需要進(jìn)行體內(nèi)大劑量的MRI增強(qiáng)使用，但如此則會(huì)產(chǎn)生大劑量的體內(nèi)毒性。由于腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤存在顱腦內(nèi)，有血腦屏障及血瘤屏障雙重阻礙，并且這種腦腫瘤是呈現(xiàn)網(wǎng)狀分散的小尺寸腫瘤，很難使造影劑顆粒富集在這些分散腫瘤表面而實(shí)現(xiàn)腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的準(zhǔn)確檢查診斷。但目前還未有表面功能肽修飾并能靶向腦腫瘤進(jìn)行影像增強(qiáng)納米材料。因此制備一種具有良好生物相容性、能穿過血腦屏障并能靶向富集在分散小尺寸膠質(zhì)瘤表面的納米顆粒就顯得尤為重要，而對(duì)這種小尺寸氫氧化釓納米棒材料進(jìn)行表面靶向修飾更是必不可少的。本專利基于釓基納米顆粒的穩(wěn)定性好、弛豫效能高、易體內(nèi)降解等特點(diǎn)，通過一種簡便的直接水熱法制備出了分散性好、尺寸細(xì)小的Gd(OH)₃納米棒。

沒有任何表面修飾的納米粒子當(dāng)被注射到血管內(nèi)時(shí)，會(huì)很快被血管內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)清除，而表面帶有親水基團(tuán)的納米粒子則不易被巨噬細(xì)胞吞噬而被清除到體外，因此具有更長的體內(nèi)半衰期。采用親水性的聚乙二醇（PEG）對(duì)納米粒子表層進(jìn)行化學(xué)修飾不僅可以提高其生物相容性，而且可以大大改善納米顆粒在體內(nèi)的停留時(shí)間，還能使其免受體內(nèi)蛋白酶的降解和提高其靶向腫瘤的幾率。Gd(OH)₃ 納米顆粒表面經(jīng)PEG修飾可使給藥顆粒在體內(nèi)的停留時(shí)間延長，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的被動(dòng)靶向。RGD肽是含有精氨酸-甘氨酸-門冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列的一類短肽，其能與腫瘤細(xì)胞表面的整合素受體特異性結(jié)合，尤其是腫瘤新生血管和腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的整合素α_vβ₃，在腫瘤引起的血管發(fā)生和腫瘤生長過程中起到重要作用，而在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞呈低水平表達(dá)。因此，為實(shí)現(xiàn)納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向性，將環(huán)狀RGD肽修飾連接在納米棒(NRs)表面，可以得到RGD-NRs。

本專利中制備的RGD 修飾的氫氧化釓納米顆粒磁共振造影劑滿足了早期腫瘤特異性強(qiáng)、用藥量低、弛豫效能高、組織相容性好、毒性低等的臨床要求。檢索國內(nèi)外有關(guān)的文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明，還未見用一步水熱法制備尺寸小而均勻的Gd(OH)₃納米棒、并對(duì)其表面靶向肽修飾后可用于體內(nèi)腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶向和T₁磁共振成像對(duì)比增強(qiáng)的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供工藝簡單、反應(yīng)條件溫和、易于操作的、具有腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶向功能的氫氧化釓納米棒的制備方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

具有神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶向功能的氫氧化釓納米棒的制備方法，包括以下步驟：

a）將濃度為0.01~1.0mmol/mL的六水合硝酸釓溶解于去離子水中，形成均勻分散的硝酸釓溶液，然后將濃度為0.1~10mmol/mL的氫氧化鈉溶液逐滴加入硝酸釓溶液中，攪拌使其pH值為13，經(jīng)反應(yīng)后轉(zhuǎn)變?yōu)楹袣溲趸徏{米顆粒的懸濁液A；

b）將懸濁液A置于高壓反應(yīng)釜內(nèi)，于電熱烘箱內(nèi)100~300℃下高溫反應(yīng)3~24h，從而使步驟a）所述氫氧化釓納米顆粒在高溫下成核、生長后得白色沉淀粉末，然后離心分離、去離子水洗滌三次、干燥后得到尺寸細(xì)小的氫氧化釓納米棒樣品；

c）將140-260mg氫氧化釓納米棒超聲分散于50mL二甲亞砜與四氯化碳的混合液B中，混合液B中二甲亞砜與四氯化碳的體積比為1:1~10，然后依次加入1~10mL氨丙基三乙氧基硅烷和10~50μL去離子水，得到混合液C；隨后混合液C在攪拌及30~100℃下反應(yīng)12~48h，然后冷卻、離心分離、洗滌、干燥后得氨基化的氫氧化釓納米棒；

d）將40-60mg氨基化的氫氧化釓納米棒超聲分散于10mL二甲亞砜中，然后加入兩端分別為馬來酰亞胺和琥珀酰亞胺修飾的聚乙二醇，即雙功能的Mal-PEG-NHS，所得混合液D在室溫及攪拌下反應(yīng)12~48h后，進(jìn)行離心分離、洗滌、干燥，得到PEG包覆的氫氧化釓納米棒；

e）將15~26mgPEG包覆的氫氧化釓納米棒超聲分散于3mL二甲亞砜中，然后加入巰基化的環(huán)狀精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸短肽1~10mg，即HS-cRGD，所得混合液E室溫下磁力攪拌反應(yīng)12~48h后，進(jìn)行離心分離、洗滌、干燥，得最終產(chǎn)物RGD修飾的氫氧化釓納米棒。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：步驟c）中，將200mg氫氧化釓納米棒超聲分散于50mL二甲亞砜與四氯化碳的混合液B中。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：步驟d）中，將50mg氨基化的氫氧化釓納米棒超聲分散于10mL二甲亞砜中。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：步驟d）中，所述雙功能Mal-PEG-NHS的加入量為10~30mg，所得混合液D室溫下磁力攪拌時(shí)間為12~48h。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：步驟e）中，將20mgPEG包覆的氫氧化釓納米棒超聲分散于3mL二甲亞砜中。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：步驟e）中，所述巰基化的環(huán)狀精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸短肽的加入量為1~10mg，所得混合液E室溫下攪拌反應(yīng)時(shí)間為12~48h。

在本發(fā)明的方法中，為得到純凈的分離產(chǎn)物，在步驟c）、d）、e）中需進(jìn)行分離和洗滌操作?？梢杂萌魏魏线m的方法進(jìn)行分離，優(yōu)選為離心分離，其離心速度優(yōu)選為3000~5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間優(yōu)選為5~10min。步驟c）的洗滌試劑優(yōu)選為去離子水，離心和洗滌次數(shù)為三次；而步驟d）、e）用于洗滌的試劑優(yōu)選為二甲基亞砜、二次水和乙醇，為獲得純化產(chǎn)物，離心和洗滌次數(shù)總共為6次，其中兩次為二甲基亞砜洗滌，兩次為二次水洗滌，最后兩次為乙醇洗滌。分離純化后的納米棒樣品可以濕態(tài)或干態(tài)儲(chǔ)存。干態(tài)儲(chǔ)存時(shí)，需要將分離產(chǎn)物在適當(dāng)溫度下干燥，其干燥溫度優(yōu)選為-20~-50℃，干燥時(shí)間優(yōu)選為18~36h。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明制備得到具有神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶向功能的RGD修飾的氫氧化釓納米棒。本發(fā)明工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作，所制備的RGD-NRs不僅棒長小(約80nm)、尺寸均勻、具有良好的生物相容性及易體內(nèi)降解，而且具有很好的T₁弛豫效應(yīng)和腦膠質(zhì)瘤靶向功能，在MRI成像診斷領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1是制備RGD修飾的氫氧化釓納米棒過程的示意圖。

圖2是氫氧化釓納米棒的透射電子顯微鏡照片。

圖3是RGD修飾的氫氧化釓納米棒的透射電子顯微鏡照片。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明提供的制備RGD修飾的氫氧化釓納米棒的方法由于對(duì)儀器設(shè)備等無特殊要求，因此易于進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)且易量產(chǎn)。以下是本發(fā)明的示例性的具體實(shí)施方案，通過這些實(shí)施方案可以更充分地理解本發(fā)明的上述及其它優(yōu)點(diǎn)。

實(shí)施例1

將2.2568g六水合硝酸釓溶解于100mL去離子水中，攪拌形成均勻的硝酸釓溶液，然后將1mmol/mL的氫氧化鈉水溶液逐滴加入上述釓鹽溶液攪拌調(diào)節(jié)pH為13，經(jīng)反應(yīng)后轉(zhuǎn)變?yōu)闅溲趸徏{米顆粒，繼續(xù)攪拌幾分鐘后將反應(yīng)后的混合液A置于高壓反應(yīng)釜內(nèi)，然后在電熱恒溫反應(yīng)干燥箱內(nèi)180℃反應(yīng)12h后得白色沉淀粉末，將所得白色沉淀離心分離，再用去離子水洗滌三次，室溫真空干燥得到分散良好的氫氧化釓納米棒（即Gd(OH)₃ NRs）；將200mg氫氧化釓納米棒超聲分散于50mL二甲亞砜與四氯化碳的混合液B中，然后依次加入1mL氨丙基三乙氧基硅烷和30μL去離子水，所得混合液C在50℃下攪拌反應(yīng)12h，再冷卻、離心分離，去離子水洗滌三次，在室溫下真空干燥后得氨基化的氫氧化釓納米棒；將50mg氨基化的氫氧化釓納米棒超聲分散于10mL二甲亞砜中，然后加入25mg雙功能的Mal-PEG-NHS，所得混合液D室溫下攪拌反應(yīng)24h，離心分離后，再用二甲基亞砜、二次蒸餾水和乙醇各洗滌兩次，干燥后得到PEG包覆的氫氧化釓納米棒（即PEG-NRs）；將20mg的PEG包覆的氫氧化釓納米棒超聲分散于3mL二甲亞砜中，然后加入5mg巰基化的環(huán)狀RGD（即HS-cRGD），所得混合液E室溫下攪拌反應(yīng)24h，離心分離后，再用二甲基亞砜、二次蒸餾水和乙醇各洗滌兩次，干燥后得最終產(chǎn)物RGD修飾的氫氧化釓納米棒（即RGD-NRs）。在對(duì)納米顆粒表面氨基化、PEG包覆、RGD修飾的過程中需進(jìn)行離心分離和洗滌操作。離心過程中，離心速度為5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為5min。分離純化后的納米顆?？梢詽駪B(tài)或干態(tài)儲(chǔ)存。干態(tài)儲(chǔ)存時(shí)，需要將分離產(chǎn)物在-20~-50℃的低溫下真空烘干24小時(shí)后在2~6℃低溫儲(chǔ)存。

實(shí)施例2

將4.5136g六水合硝酸釓溶解于100mL去離子水中，攪拌分散形成均勻分散的硝酸釓溶液，然后將1mmol/mL的氫氧化鈉水溶液逐滴加入上述釓鹽溶液攪拌調(diào)節(jié)pH為13，經(jīng)反應(yīng)后轉(zhuǎn)變?yōu)闅溲趸徏{米顆粒，繼續(xù)攪拌幾分鐘后將反應(yīng)后的混合液A置于高壓反應(yīng)釜內(nèi)，然后于電熱恒溫干燥箱內(nèi)160℃反應(yīng)12h后得白色沉淀粉末，再將其離心分離，并用去離子水洗滌三次，室溫真空干燥得到分散良好的氫氧化釓納米棒（Gd(OH)₃NRs）；將200mg氫氧化釓納米棒超聲分散于50mL二甲亞砜與四氯化碳的混合液B中，然后依次加入1mL氨丙基三乙氧基硅烷和30μL去離子水，所得混合液C 在70℃下攪拌反應(yīng)12h后冷卻、離心分離，去離子水洗滌三次，室溫真空干燥后得氨基化的氫氧化釓納米棒；將50mg氨基化的氫氧化釓納米棒超聲分散于10mL二甲亞砜中，然后加入25mg雙功能的Mal-PEG-NHS，所得混合液D在室溫下磁力攪拌反應(yīng)24h，再離心分離，去離子水洗滌三次，干燥后得PEG包覆的氫氧化釓納米棒（即PEG-NRs）；將20mg的PEG包覆的氫氧化釓納米棒超聲分散于10mL二甲亞砜中，然后加入5mg巰基化的環(huán)狀RGD（即HS-cRGD），所得混合液E室溫下攪拌反應(yīng)24h，再用二甲基亞砜、二次蒸餾水和乙醇各洗滌兩次，真空干燥后得最終產(chǎn)物RGD修飾的氫氧化釓納米棒（即RGD-NRs）。在對(duì)納米顆粒表面氨基化、PEG包覆、RGD修飾的過程中需進(jìn)行離心分離和洗滌操作。離心過程中，離心速度為4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為10min。分離純化后的納米顆?？梢詽駪B(tài)或干態(tài)儲(chǔ)存。干態(tài)儲(chǔ)存時(shí)，需要將分離產(chǎn)物在室溫下真空干燥24小時(shí)后在2~6℃低溫儲(chǔ)存。

實(shí)施例3

將2.2568g六水合硝酸釓溶解于100mL去離子水中，攪拌分散形成均勻分散的硝酸釓溶液，然后將1mmol/mL的氫氧化鈉水溶液逐滴加入上述釓鹽溶液攪拌調(diào)節(jié)pH為13，經(jīng)反應(yīng)后轉(zhuǎn)變?yōu)闅溲趸徏{米顆粒，繼續(xù)攪拌幾分鐘后將反應(yīng)后的混合液A置于高壓反應(yīng)釜內(nèi)，然后于電熱恒溫干燥箱內(nèi)180℃反應(yīng)6h后得白色沉淀粉末，然后將其離心分離，并用去離子水洗滌三次，在室溫下真空干燥得到分散良好的氫氧化釓納米棒（即Gd(OH)₃NRs）；將200mg氫氧化釓納米棒超聲分散于50mL二甲亞砜與四氯化碳的混合液B中，然后依次加入1mL氨丙基三乙氧基硅烷和30μL去離子水，所得混合液C在60℃下攪拌反應(yīng)12h，再冷卻、離心分離，去離子水洗滌三次，在室溫下真空干燥后得氨基化的氫氧化釓納米棒；將50mg氨基化的氫氧化釓納米棒超聲分散于10mL二甲亞砜中，然后加入25mg雙功能的Mal-PEG-NHS，所得混合液D室溫下攪拌反應(yīng)48h，再用二甲基亞砜、二次蒸餾水和乙醇各洗滌兩次，在室溫下真空干燥后得PEG包覆的氫氧化釓納米棒（即PEG-NRs）；將20mgPEG包覆的氫氧化釓納米棒超聲分散于10mL二甲亞砜中，然后加入5mg巰基化的環(huán)狀RGD（即HS-cRGD），所得混合液E室溫下攪拌反應(yīng)48h，再用二甲基亞砜、二次蒸餾水和乙醇各洗滌兩次，真空干燥后得最終產(chǎn)物RGD修飾的氫氧化釓納米棒（即RGD-NRs）。在對(duì)納米顆粒表面氨基化、PEG包覆、RGD修飾的過程中需進(jìn)行離心分離和洗滌操作。離心過程中，離心速度為4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為10min。分離純化后的納米顆粒可以濕態(tài)或干態(tài)儲(chǔ)存。干態(tài)儲(chǔ)存時(shí)，需要將分離產(chǎn)物在-20~-50℃的低溫下真空烘干24小時(shí)后在2~6℃低溫儲(chǔ)存。

本發(fā)明實(shí)施例中，本發(fā)明中氫氧化釓納米棒的制備是通過滴加混合再水熱法實(shí)現(xiàn)的，并對(duì)其表面進(jìn)行RGD修飾。圖1是制備RGD修飾的氫氧化釓納米棒過程的示意圖，由該圖可見本發(fā)明具有工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作等優(yōu)點(diǎn)。圖2是氫氧化釓納米棒的透射電子顯微鏡照片，由該圖可知所制備的氫氧化釓納米棒的尺寸分布很均勻，且其長度和直徑分別為70~90nm和15~20nm。圖3示出RGD修飾的氫氧化釓納米棒的透射電子顯微鏡照片，由該圖可看出氫氧化釓納米棒表面的多肽包覆，且包覆后的氫氧化釓納米棒有輕微的團(tuán)聚，但不影響其在體內(nèi)靶向使用。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。