本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種可控表面孔洞打開或關(guān)閉，且內(nèi)部具有孔洞結(jié)構(gòu)的微載體及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

細(xì)胞療法(Cell therapy)，是繼小分子藥物、醫(yī)療器械、蛋白藥物(抗體疫苗)之后的第四大類治療方法。它以活的人體細(xì)胞為治療材料，通過體外培養(yǎng)擴增，獲得足夠多細(xì)胞數(shù)量后，注射回人體，治療普通藥物無法治愈的多種疾病，如組織缺陷受損、各種癌癥等。所有的細(xì)胞療法都需要一個體外培養(yǎng)擴增細(xì)胞的過程，且對于干細(xì)胞和其他多數(shù)成熟細(xì)胞等都需要貼在物體表面才能生長。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法是將細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中，單位體積培養(yǎng)效率低下。

微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)最有發(fā)展前途的一種動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點。目前已公布的關(guān)于微載體制備的專利申請有CN200510061868.3，CN201310264873.9，CN201510347440.9，CN00128164.X，然而這些微載體由于表面光滑或者孔洞較小，在攪拌過程中細(xì)胞不僅不易貼附其表面，而且還會受到剪切力的傷害；傳統(tǒng)方法制備的微載體內(nèi)部實心，密度較大，不易在培養(yǎng)基中保持懸浮狀態(tài)。此外多孔結(jié)構(gòu)的微載體比表面光滑的微載體有更大的比表面積，可應(yīng)用于藥物緩釋或催化劑負(fù)載材料

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的是提供一種微載體，其表面孔洞打開或關(guān)閉，且內(nèi)部具有孔洞結(jié)構(gòu)，以解決現(xiàn)有技術(shù)中上述缺陷。

本發(fā)明的第二目的是提供一種微載體的制備方法，制得一種表面孔洞打開或關(guān)閉，且內(nèi)部具有孔洞結(jié)構(gòu)的微載體，以解決現(xiàn)有技術(shù)中上述缺陷。

本發(fā)明的第三目的是提供一種上述的微載體的用途，用于細(xì)胞培養(yǎng)、藥物緩釋或組織修復(fù)填充等用途，以解決現(xiàn)有技術(shù)中上述缺陷。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種微載體，所述的微載體的粒徑大小為50～1000μm，所述的微載體表面的孔洞大小為0～500μm，且內(nèi)部具有孔洞結(jié)構(gòu)，所述的微載體包括以下步驟制得：

(1)混合相溶液的制備

將聚合物與發(fā)泡劑溶于不同極性的溶液中，充分混勻兩相溶液得到混合相溶液；

(2)微載體的制備

將所述的混合相溶液加到表面活性劑的水溶液中，經(jīng)混勻、后處理得到表面孔洞關(guān)閉或表面孔洞打開的所述的微載體，所述的表面孔洞關(guān)閉的微載體與堿或酸溶液混合攪拌，并經(jīng)后處理得到表面孔洞打開的所述的微載體。

本發(fā)明還公開了一種上述的微載體的制備方法，包括以下步驟：

(1)混合相溶液的制備

將所述的聚合物溶于所述的非極性溶劑中形成所述的第一溶液，將所述的發(fā)泡劑溶于所述的極性溶劑中形成所述的第二溶液，所述的第二溶液加入到所述的第一溶液，充分混勻得到所述的混合相溶液；

(2)微載體的制備

將所述的混合相溶液加到表面活性劑的水溶液中，經(jīng)混勻、后處理得到表面孔洞關(guān)閉或表面孔洞打開的所述的微載體，所述的表面孔洞關(guān)閉的微載體與堿或酸溶液混合攪拌，并經(jīng)后處理得到表面孔洞打開的所述的微載體。

進(jìn)一步的優(yōu)選，所述的聚合物為聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚乳酸(LA)-乙醇酸(GA)共聚物其中的一種，具體由乳酸、乙醇酸、己內(nèi)酯、苯乙烯，丙烯酸-C₄-C₈烷基酯，甲基丙烯酸C₄-C₈烷基酯或烷基芳基酯作為單體單元的共聚物組成的聚合物，更優(yōu)優(yōu)選為聚乳酸(LA)-乙醇酸(GA)共聚物，其中LA:GA的比為100:0～50:50，所述的聚合物的分子量為5000～50000。

進(jìn)一步的優(yōu)選，所述的非極性溶劑為一種可溶解高分子聚合物且沸點較低的有機溶劑，包括但不局限于乙醇、甲醚、二氯甲烷、三氯甲烷或乙醚其中的一種或幾種；所述的極性溶劑為水。

進(jìn)一步的優(yōu)選，所述的發(fā)泡劑為銨鹽(NH₄HCO₃,NH₄HPO₄等)、碳酸鹽(NaHCO₃,KHCO₃等)或H₂O₂等能形成氣體的無機物，更為優(yōu)選為碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、亞硝酸銨其中的一種或幾種。

進(jìn)一步的優(yōu)選，所述的表面活性劑為陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑，包括但不局限于聚乙烯醇PVA，十二烷基硫酸鈉，Tween 80，十二烷基苯磺酸鈉其中的一種或幾種。

進(jìn)一步的優(yōu)選，所述的第二溶液加入到所述的第一溶液的體積比為1:5～1:2，所述的第一溶液的聚合物濃度為20～500mg/mL，所述的第二溶液的發(fā)泡劑濃度為10～30mg/mL。

進(jìn)一步的優(yōu)選，所述的步驟(1)混合相溶液的制備是在溫度為4～50℃，攪拌速度為5000～12000rpm/min，攪拌時間為10～120s下進(jìn)行。

進(jìn)一步的優(yōu)選，所述的混合相溶液通過注射器注射到所述的表面活性劑水溶液中，所述的注射器的針孔內(nèi)徑為130～1250μm。

進(jìn)一步的優(yōu)選，所述的混合相溶液加入到所述的表面活性劑水溶液的體積比為1:10～1:100，所述的表面活性劑水溶液濃度為5～50mg/mL。

進(jìn)一步的優(yōu)選，所述的步驟(2)表面孔洞關(guān)閉的所述的微載體的制備是在溫度為4～50℃，攪拌速度為100～2000rpm/min，攪拌時間為5min以上，干燥溫度小于50℃下進(jìn)行。

進(jìn)一步的優(yōu)選，所述的步驟(2)的堿溶液為氫氧化物鹽溶液，更為優(yōu)選為氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液其中的一種或兩種；所述的酸溶液為弱酸溶液，更為優(yōu)選為草酸或稀鹽酸其中的一種或兩種。

進(jìn)一步的優(yōu)選，所述的堿溶液OH^-1的濃度為≤50mM，所述的微載體加入堿液的濃度為100mg/L-1000mg/L；

進(jìn)一步的優(yōu)選，所述的步驟(2)表面孔洞打開的所述的微載體的制備是在溫度4～50℃，攪拌速度小于2000rpm/min，反應(yīng)時間小于30min下進(jìn)行。

本發(fā)明還公開了一種上述的微載體的用途，所述的微載體用于細(xì)胞培養(yǎng)、藥物緩釋或組織修復(fù)填充等用途。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

(1)材料可降解：制備微載體的材料為聚乳酸(LA)-乙醇酸(GA)共聚物，聚乳酸在生物體內(nèi)或者在生理鹽水中經(jīng)過一定時間可降解為乳酸；

(2)制備方法簡單：本發(fā)明的制備方法無需經(jīng)復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，且制備過程中不涉及劇毒難清洗的化學(xué)物質(zhì)；

(3)微載體多樣：本發(fā)明的制備方法通過調(diào)節(jié)發(fā)泡劑和聚乳酸的配比就可得到不同表面形貌的細(xì)胞載體，如表面多孔(如圖2所示)，表面孔洞關(guān)閉(即表面褶皺(如圖4所示)或表面光滑(如圖5、6所示))，且內(nèi)部均為孔洞結(jié)構(gòu)的微載體，從而滿足實際的不同應(yīng)用需求，此外可通過向表面孔洞關(guān)閉的微載體加入堿或酸溶液將其表面孔洞打開，得到表面孔洞打開的微載體(如圖7所示)；

(4)生物相容性好：利用本發(fā)明制得的微載體培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞具有很好存活狀態(tài)且增殖明顯，比普通二維培養(yǎng)增殖速度更快；

(5)本發(fā)明的制備方法，可制得表面多孔且內(nèi)部具有孔洞結(jié)構(gòu)的微載體，使得細(xì)胞可以在微載體內(nèi)擴增，因此可減小溶液攪拌時，剪切力對細(xì)胞的傷害且該微載體比傳統(tǒng)的實心微載體的密度更低，更容易懸浮在溶液中，只需要很小的攪拌力即可實現(xiàn)微載體的懸浮，并與營養(yǎng)液混勻；或可制得表面孔洞關(guān)閉且內(nèi)部具有孔洞結(jié)構(gòu)的微載體，因此，比市場上現(xiàn)有實心微載體有更高的細(xì)胞貼附率，且因密度小，有利于在溶液中懸浮和與營養(yǎng)液混勻；

(6)本發(fā)明的制備方法，制得表面多孔且內(nèi)部具有孔洞結(jié)構(gòu)的微載體，除了培養(yǎng)貼壁細(xì)胞外，當(dāng)其孔洞大于10微米時，可以用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，使懸浮細(xì)胞鉆進(jìn)孔洞中生長。

當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品或方法并不一定需要同時達(dá)到以上所述的所有優(yōu)點。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的一種微載體的制備方法的路線圖；

圖2為實施例1利用本發(fā)明的一種微載體的制備方法制得的微載體的光學(xué)顯微鏡圖和掃描電子顯微鏡圖，其中a為光學(xué)顯微鏡圖，b為掃描電子顯微鏡圖；

圖3為利用實施例1制得的微載體培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量與普通細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量的柱狀圖；

圖4為實施例2利用本發(fā)明的一種微載體的制備方法制得的微載體的光學(xué)顯微鏡圖和掃描電子顯微鏡圖，其中a為光學(xué)顯微鏡圖，b為掃描電子顯微鏡圖；

圖5為實施例3利用本發(fā)明的一種微載體的制備方法制得的微載體的光學(xué)顯微鏡圖和掃描電子顯微鏡圖，其中a為光學(xué)顯微鏡圖，b為掃描電子顯微鏡圖

圖6為實施例4利用本發(fā)明的一種微載體的制備方法制得的微載體的掃描電子顯微鏡圖，其中a為其整體圖，b為其剖面圖；

圖7為實施例5利用本發(fā)明的一種微載體的制備方法制得的微載體培養(yǎng)細(xì)胞后的掃描電子顯微鏡圖，其中a為1800倍，b為3300倍。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)該理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的保護范圍。在實際應(yīng)用中本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明做出的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明沒有特別說明，本發(fā)明所使用的材料、試劑等，均可從市場上商業(yè)途徑獲得，光學(xué)顯微鏡為Nikon TMS-F，掃描電子顯微鏡為Phenom ProX。

如圖1所示的是本發(fā)明的一種微載體的制備方法的路線圖，具體包括以下步驟：

(1)混合相溶液的制備

將聚乳酸溶于非極性溶劑中形成第一溶液，將發(fā)泡劑溶于極性溶劑中形成第二溶液，所述的第二溶液加入到所述的第一溶液，利用高速勻漿機高速充分混勻得到混合相溶液；

(2)微載體的制備

將所述的混合相溶液加到表面活性劑的水溶液中，經(jīng)混勻攪拌、過慮、洗滌和干燥得到表面孔洞關(guān)閉或表面孔洞打開的所述的微載體，所述的表面孔洞關(guān)閉的微載體與堿溶液混合攪拌，并經(jīng)過慮、洗滌和干燥等后處理得到表面孔洞打開的所述的微載體。

所述的微載體的粒徑大小為50～1000μm，所述的微載體的粒徑大小可通過制備微載體的溫度、攪拌速度以及注射器針孔內(nèi)徑來控制；所述的微載體表面的孔洞大小為0～500μm，所述的微載體表面的孔洞大小由發(fā)泡劑和聚乳酸的相對量來控制。

本發(fā)明還公開了一種上述的微載體的用途，所述的微載體用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，還可以用作藥物緩釋材料或組織修復(fù)填充材料等用途。

本發(fā)明通過將聚合物與發(fā)泡劑溶于不同極性的溶液中，利用高速勻漿攪拌將兩相溶液混合均勻后，并經(jīng)注射器注射到表面活性劑水溶液中，經(jīng)混勻、后處理得到表面孔洞關(guān)閉或表面孔洞打開的所述的微載體，所述的表面孔洞關(guān)閉的微載體與堿溶液混合攪拌，并經(jīng)后處理得到表面孔洞打開的所述的微載體。本發(fā)明的制備方法操作簡單，反應(yīng)過程中不涉及有毒有害的物質(zhì)，可分別通過制備微載體的溫度、攪拌速度以及注射器針孔內(nèi)徑來控制所述的微載體的粒徑和通過發(fā)泡劑和聚乳酸的相對量來控制所述的微載體表面的孔洞大小，從而制得一種可控表面孔洞打開或關(guān)閉，且內(nèi)部具有孔洞結(jié)構(gòu)的微載體，此外可通過向表面孔洞關(guān)閉的微載體加入堿或酸溶液將其表面孔洞打開，得到表面孔洞打開的微載體，本發(fā)明的微載體具有良好的生物相容性，作為一種微載體應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。與傳統(tǒng)細(xì)胞載體相比，本發(fā)明的微載體內(nèi)部具有豐富的孔洞結(jié)構(gòu)，密度小，易于懸浮于培養(yǎng)基中；通過控制微載體表面形貌，使微載體的表面可分別表現(xiàn)為開孔，閉孔光滑，或者閉孔褶皺的形貌，從而分別用于懸浮細(xì)胞和不同貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)；或者用于不同藥物緩釋或者催化劑的載體材料。

下面將通過若干實施例進(jìn)一步的闡述和理解本發(fā)明。

實施例1

一種微載體的制備方法，包括如下步驟：

(1)混合相溶液的制備：

稱取LA:GA＝100：0的分子量10000的聚乳酸300mg溶于8mL二氯甲烷，得到第一溶液，配制濃度為16mg/mL碳酸氫銨水溶液，得到第二溶液，取2.5mL第二溶液加入到第一溶液中，在25℃下經(jīng)高速勻漿機高速充分混勻，攪拌速度為8000rpm/min，攪拌時間為1min，得到一均勻的混合相溶液；

(2)微載體的制備：

經(jīng)配有410μm內(nèi)徑針孔的注射器，將步驟(1)制得的混合相溶液快速注射到300mL 20mg/mL的十二烷基硫酸鈉水溶液中，在25℃下，經(jīng)磁力攪拌混勻，攪拌速度為900rpm/min，攪拌時間為2小時；然后再通過孔徑為120目的紗網(wǎng)過濾，并經(jīng)純水沖洗，洗滌數(shù)次后置于室溫下，自然揮發(fā)干燥得到所述的微載體。

結(jié)構(gòu)表征與性能測試：

利用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡對實施例1制得的微載體進(jìn)行顯微觀察分析，如圖2所示，其中a為光學(xué)顯微鏡圖，b為掃描電子顯微鏡圖；從圖2中可以看出，制得的微載體的表面具有豐富的孔洞，呈球形結(jié)構(gòu)，粒徑為100～400μm，孔洞內(nèi)徑為0～50μm；

同時，將該制得的微載體應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)，利用本實施例1的微載體培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量與普通細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行對比，如圖3所示。

實驗條件為：將適量微載體的表面修飾后，用生理鹽水浸泡，浸泡后高壓消毒。經(jīng)過消毒的微載體用含血清的培養(yǎng)基浸泡，在培養(yǎng)箱中孵育1小時，離心并用新鮮培養(yǎng)基重懸，接種于24孔板中，使其鋪滿底面。將Hela細(xì)胞接種于鋪滿微載體的24孔板中，每孔接種50000個細(xì)胞，同時設(shè)置對照組，將24孔板放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。將24孔板從培養(yǎng)箱中取出，用胰蛋白酶將細(xì)胞從微載體上脫離下來，收集上清，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并與對照組細(xì)胞進(jìn)行對比。

實施例2

一種微載體的制備方法，本實施例的操作步驟、方法及條件均與實施例1相同，兩者的區(qū)別僅在于：稱取LA:GA＝100：0的分子量為10000的聚乳酸200mg溶于4mL二氯甲烷，得到所述的第一溶液；所述的第二溶液的碳酸氫銨濃度為10mg/mL；高速勻漿攪拌和磁力攪拌均在溫度為25℃下進(jìn)行。

性能測試：

通過與實施例1相同的顯微鏡觀察可知，本實施例2制備的微載體的粒徑大于為200μm，表面沒有開孔，呈封閉狀態(tài)，表面具有經(jīng)典的褶皺，如圖4所示，其中a為光學(xué)顯微鏡圖，b為掃描電子顯微鏡圖。同時，將本實施例2的微載體應(yīng)用于細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后，經(jīng)顯微鏡觀察，該微載體培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量比普通細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量明顯的多，且存活狀態(tài)好。

實施例3

一種微載體的制備方法，本實施例的操作步驟、方法及條件均與實施例1相同，兩者的區(qū)別僅在于：稱取LA:GA＝100:0的分子量10000的聚乳酸400mg溶于4mL二氯甲烷，得到所述的第一溶液；量取1.25mL的20mg/mL碳酸氫銨溶液加入的到所述的第一溶液；高速勻漿攪拌和磁力攪拌均在溫度為25℃下進(jìn)行。

性能測試：

通過與實施例1相同的顯微鏡觀察可知，本實施例3制備的微載體的粒徑大于為200μm，表面沒有開孔，呈封閉狀態(tài)、表面光滑，如圖5所示，其中a為光學(xué)顯微鏡圖，b為掃描電子顯微鏡圖。同時，將本實施例3的微載體應(yīng)用于細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后，經(jīng)顯微鏡觀察，該微載體培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量比普通細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量明顯的多，且存活狀態(tài)好。

實施例4

一種微載體的制備方法，本實施例的操作步驟、方法及條件均與實施例1相同，兩者的區(qū)別僅在于：稱取LA:GA＝75：25的分子量為10000的聚乳酸125mg溶于8mL二氯甲烷，得到所述的第一溶液；所述的第二溶液的碳酸氫銨濃度為10mg/mL，表面活性劑為400mL 10g/L聚乙烯醇溶液；高速勻漿攪拌和磁力攪拌均在溫度為25℃下進(jìn)行。

性能測試

通過與實施例1相同的顯微鏡觀察可知，本實施例4制備的微載體的粒徑大約為80μm，表面沒有開孔，呈封閉狀態(tài)、表面光滑，如圖6掃描電子顯微鏡圖所示，其中a為單個粒子，b為粒子切面圖。同時，將本實施例4的微載體應(yīng)用于細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后，經(jīng)顯微鏡觀察，該微載體培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量比普通細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量明顯的多，且存活狀態(tài)好。

實施例5

本實施例是將實施例4的微載體經(jīng)過開孔得到。本實施例步驟為：稱取實施例3的微載體200mg，加入到0.01M氫氧化鈉溶液中，200rpm/min攪拌30s，過濾洗滌，30℃烘干。

通過與實施例1相同的顯微鏡觀察可知，本實施例5制備的微載體的粒徑與實施例4的類似，但表面開孔。同時，將本實施例5的微載體應(yīng)用于細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后，經(jīng)顯微鏡觀察，該微載體培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量比普通細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量明顯的多，且存活狀態(tài)好，如圖6掃描電子顯微鏡圖所示。

與現(xiàn)有市場上的微載體相比，本發(fā)明的制備方法可控制微載體表面和內(nèi)部孔洞的結(jié)構(gòu)，即可制得表面多孔且內(nèi)部具有孔洞結(jié)構(gòu)的微載體，使得細(xì)胞可以在微載體內(nèi)擴增，因此可減小溶液攪拌時，剪切力對細(xì)胞的傷害且該形態(tài)的微載體比傳統(tǒng)的實心微載體密度低，更容易懸浮在溶液中，只需要很小的攪拌力即可實現(xiàn)微載體的懸浮，并與營養(yǎng)液很好的混勻；或可制得表面孔洞關(guān)閉且內(nèi)部具有孔洞結(jié)構(gòu)，因此，比市場上現(xiàn)有實心微載體有更高的細(xì)胞貼附率，且因密度小，有利于在溶液中懸浮和與營養(yǎng)液的混勻。本發(fā)明的一種微載體在細(xì)胞培養(yǎng)中，具有較好的應(yīng)用前景。

以上公開的本發(fā)明優(yōu)選實施例只是用于幫助闡述本發(fā)明。優(yōu)選實施例并沒有詳盡敘述所有的細(xì)節(jié)，也不限制該發(fā)明僅為所述的具體實施方式。顯然，根據(jù)本說明書的內(nèi)容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實施例，是為了更好地解釋本發(fā)明的原理和實際應(yīng)用，從而使所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員能很好地理解和利用本發(fā)明。本發(fā)明僅受權(quán)利要求書及其全部范圍和等效物的限制。