本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，涉及單核細(xì)胞趨化蛋白-1誘導(dǎo)蛋白1（Mcpip1）在肝缺血再灌注損傷中的應(yīng)用，具體涉及Mcpip1在篩選或制備預(yù)防、緩解和/或治療肝缺血再灌注損傷物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：臨床上在肝臟切除、處理肝臟嚴(yán)重創(chuàng)傷及肝臟移植手術(shù)過(guò)程中，通常需要阻斷肝門血流，原本缺血時(shí)受損的肝細(xì)胞在血供恢復(fù)后損傷非但沒(méi)有減輕，反而出現(xiàn)加重的現(xiàn)象，稱為肝臟缺血再灌注損傷（hepaticischemiareperfusioninjury，HIRI）[1]。HIRI可使肝臟代謝、解毒功能降低，嚴(yán)重者引起肝功能衰竭，直接影響到疾病的預(yù)后、手術(shù)成功率和患者生存率。如何減輕HIRI，是當(dāng)前肝臟外科面臨的重大難題。HIRI是一個(gè)多因素參與、多種信號(hào)通路共同發(fā)揮作用的病理生理過(guò)程，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。HIRI涉及肝細(xì)胞與多種非實(shí)質(zhì)細(xì)胞如肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、kupffer細(xì)胞、星狀細(xì)胞以及浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞之間的相互作用，活化的補(bǔ)體系統(tǒng)也參與其中[2]。其病理特點(diǎn)主要是：（1）kupffer細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的活化引起肝組織細(xì)胞受損；（2）鈣超載、氧自由基及細(xì)胞因子的釋放和活化引起炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、壞死；（3）肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的損害導(dǎo)致微循環(huán)障礙，進(jìn)一步加重組織缺血、引起細(xì)胞壞死凋亡等不可逆損害[3]。從上世紀(jì)80年代開始，人們開始尋找能減輕HIRI的途徑和方法，外科手術(shù)干預(yù)、缺血預(yù)處理、藥物預(yù)處理和缺血后處理等[4]已逐漸應(yīng)用于臨床。但迄今為止，上述策略尚未能妥善解決臨床上HIRI對(duì)肝臟的損傷問(wèn)題。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)等領(lǐng)域的深入研究，針對(duì)HIRI相關(guān)的重要功能基因的靶向治療為HIRI的防治開辟了新的途徑。單核細(xì)胞趨化蛋白-1誘導(dǎo)蛋白1（monocytechemotacticprotein-1inducedprotein1，Mcpip1）是一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的CCCH型鋅指家族分子，最初被發(fā)現(xiàn)于經(jīng)MCP-1處理的人外周血單核細(xì)胞中[5]。目前的研究表明，Mcpip1的功能主要集中于以下四個(gè)方面：（1）作為轉(zhuǎn)錄因子，Mcpip1能夠激活凋亡相關(guān)基因如JNK、p38等的轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[6]；（2）作為RNA酶，Mcpip1能夠降解炎癥相關(guān)細(xì)胞因子如IL-2、IL-6、IL12p40、Calcr、IL-1β等的mRNA，發(fā)揮其對(duì)炎癥反應(yīng)負(fù)向調(diào)控的作用[7]；（3）作為去泛素化酶，Mcpip1可去泛素化一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)分子如TRAFs、RIP、NEMO等[8]。Mcpip1可以通過(guò)上述多種機(jī)制參與細(xì)胞內(nèi)的多種病理過(guò)程，維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。HIRI的發(fā)病機(jī)理與炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，研究Mcpip1在HIRI發(fā)病過(guò)程中的功能作用，望其成為防治HIRI的一個(gè)重要潛在靶點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：1.Serracino-Inglott,F.,N.A.Habib,andR.T.Mathie,Hepaticischemia-reperfusioninjury.AmJSurg,2001.181(2):p.160-6.2.Li,A.M.,etal.,Effectsoftherapeutichypercapniaoninflammationandapoptosisafterhepaticischemia-reperfusioninjuryinrats.ChinMedJ(Engl),2010.123(16):p.2254-8.3.deRougemont,O.,P.Dutkowski,andP.A.Clavien,Biologicalmodulationofliverischemia-reperfusioninjury.CurrOpinOrganTransplant,2010.15(2):p.183-9.4.Li,J.,etal.,Themechanismsandstrategiestoprotectfromhepaticischemia-reperfusioninjury.EurRevMedPharmacolSci,2015.19(11):p.2036-47.5.Zhou,L.,etal.,Monocytechemoattractantprotein-1inducesanoveltranscriptionfactorthatcausescardiacmyocyteapoptosisandventriculardysfunction.CircRes,2006.98(9):p.1177-85.6.Qi,D.,etal.,Monocytechemotacticprotein-inducedprotein1(Mcpip1)suppressesstressgranuleformationanddeterminesapoptosisunderstress.JBiolChem,2011.286(48):p.41692-700.7.Matsushita,K.,etal.,Zc3h12aisanRNaseessentialforcontrollingimmuneresponsesbyregulatingmRNAdecay.Nature,2009.458(7242):p.1185-90.8.Liang,J.,etal.,MCP-inducedprotein1deubiquitinatesTRAFproteinsandnegativelyregulatesJNKandNF-kappaBsignaling.JExpMed,2010.207(13):p.2959-73。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決臨床防治肝缺血疾病現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于確定Mcpip1基因的表達(dá)與肝缺血再灌注損傷之間的相互關(guān)系，提供一種用于治療肝缺血再灌注損傷的靶基因Mcpip1的新應(yīng)用，即Mcpip1作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療肝缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用，以及Mcpip1在制備用于預(yù)防、緩解和/或治療肝缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用，進(jìn)而把Mcpip1基因應(yīng)用于肝缺血疾病的治療。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明以肝細(xì)胞特異性Mcpip1基因敲除小鼠和Mcpip1轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)肝缺血再灌注損傷模型研究Mcpip1基因的功能。結(jié)果表明：與野生型C57BL/6小鼠相比，肝細(xì)胞特異性Mcpip1基因敲除小鼠肝臟壞死面積明顯增加；與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比，Mcpip1轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟壞死面積則明顯減少。這提示Mcpip1基因具有保護(hù)肝功能的作用，為Mcpip1在研究防治肝缺血的新靶點(diǎn)和新策略中所發(fā)揮的作用提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。本發(fā)明的研究證明了：在肝缺血再灌注損傷模型中，Mcpip1具有抑制肝臟壞死、減少肝細(xì)胞凋亡、保護(hù)肝功能的作用。一種Mcpip1基因在肝缺血再灌注損傷中的功能，主要體現(xiàn)在Mcpip1具有保護(hù)肝功能的作用，特別是Mcpip1具有改善肝缺血再灌注損傷的作用。針對(duì)Mcpip1改善肝缺血再灌注損傷的功能，Mcpip1具有如下應(yīng)用：Mcpip1作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療肝缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用。該應(yīng)用是非診斷和治療的目的；所述的篩選預(yù)防、緩解和/或治療肝缺血再灌注損傷的藥物，是指篩選夠促進(jìn)Mcpip1基因表達(dá)的藥物。Mcpip1在制備預(yù)防、緩解和/或治療肝缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：（1）本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Mcpip1基因的新功能，即Mcpip1基因能夠抑制肝缺血再灌注損傷，且與肝細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。（2）基于Mcpip1在抑制肝缺血再灌注損傷中的作用，其可以用于篩選或制備預(yù)防、緩解和/或治療肝缺血再灌注損傷的藥物。附圖說(shuō)明圖1是肝細(xì)胞特異性Mcpip1基因敲除小鼠的構(gòu)建策略圖及所構(gòu)建小鼠組織中Mcpip1蛋白表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果圖。A為肝細(xì)胞特異性Mcpip1基因敲除小鼠的構(gòu)建策略圖；B為組織中Mcpip1蛋白表達(dá)量的WesternBlot檢測(cè)結(jié)果圖。圖2是肝細(xì)胞特異性Mcpip1轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建策略圖及所構(gòu)建小鼠肝臟組織中Mcpip1蛋白表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果圖。A為肝細(xì)胞特異性Mcpip1轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建策略圖；B為肝臟組織中Mcpip1蛋白表達(dá)量的WesternBlot檢測(cè)結(jié)果圖（TG1、TG2、TG3、TG4為不同的轉(zhuǎn)基因小鼠個(gè)體）。圖3是小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟的壞死情況對(duì)比圖。A為WT和Mcpip1-LKO小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟HE染色圖及壞死面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖；B為NTG和Mcpip1-TG小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟HE染色圖及壞死面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖（*：P＜0.05vsWTI/R組；#：P＜0.05vsNTGI/R組）。圖4是小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計(jì)比較圖。A為WT和Mcpip1-LKO小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計(jì)柱狀圖；B為NTG和Mcpip1-TG小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計(jì)柱狀圖（*：P＜0.05vsWTSham組；#：P＜0.05vsWT/NTG對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)I/R組）。圖5是小鼠缺血在再灌注24h時(shí)TUNEL細(xì)胞數(shù)的柱狀統(tǒng)計(jì)圖。A為WT和Mcpip1-LKO小鼠在再灌注24h時(shí)TUNEL免疫熒光及柱狀統(tǒng)計(jì)圖；B為NTG和Mcpip1-TG小鼠在再灌注12h時(shí)TUNEL免疫熒光及柱狀統(tǒng)計(jì)圖（*：P＜0.05vsWT/NTGI/R組）。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用8-10周齡、體重在24g-27g、背景為雄性C57BL/6品系的野生型小鼠（WT，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司）、肝細(xì)胞特異性Mcpip1基因敲除小鼠（Mcpip1-LKO）及Mcpip1轉(zhuǎn)基因小鼠（Mcpip1-TG）（由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心李紅良老師實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建）、非轉(zhuǎn)基因小鼠（NTG，同窩對(duì)照非轉(zhuǎn)基因小鼠）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。飼養(yǎng)環(huán)境：所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SRF級(jí)小鼠飼料購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養(yǎng)條件：室溫在22-24℃之間，濕度在40-70%之間，明暗交替照明時(shí)間為12h，自由飲水?dāng)z食。實(shí)施例1肝細(xì)胞特異性Mcpip1基因敲除小鼠以及Mcpip1轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建（1）肝細(xì)胞特異性Mcpip1基因敲除小鼠的構(gòu)建（構(gòu)建策略見(jiàn)圖1A）根據(jù)Mcpip1基因的信息，利用CRISPRDesign分別在內(nèi)含子2和3中各設(shè)計(jì)一個(gè)CRISPR的打靶位點(diǎn)，靶序列分別為：Mcpip1-sRNA1：ggCACTGGCTCCCCACGTAGAGGGGMcpip1-sRNA2：gGCCCTTACCTGAGTAACTTAGGG此外還設(shè)計(jì)了一個(gè)用于同源修復(fù)的供體載體（DonorVector），它包括兩側(cè)同源臂、中間的外顯子3以及兩個(gè)同向的loxp序列。1）打靶載體的構(gòu)建：分別將sgRNA1和sgRNA2對(duì)應(yīng)的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4DNA連接酶連入經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶BsaI處理過(guò)的pUC57-sgRNA（Addgene51132）載體中。該載體上游有一個(gè)T7啟動(dòng)子，可以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。2）條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp的構(gòu)建：分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列：loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT；loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA；loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescriptIISK(+)載體用HindIII（NEB，R0104L）和EcoRV（NEB，R0195L）雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈，再將測(cè)序正確的載體用BamHI（NEB，R0136L）和SpeI（NEB，R0133L）雙酶切，連接入loxp2退火雙鏈，得到條件性敲除骨架載體，命名為pBluescriptSK(+)-2loxp。3）供體載體（DonorVector）的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)如下引物（表1），以小鼠gDNA為模板，擴(kuò)增供體載體的左右同源臂（LA和RA）以及中間的外顯子部分（M）。上述擴(kuò)增得到的產(chǎn)物及pBluescriptSK(+)-2loxp載體經(jīng)表1中所示限制性內(nèi)切酶酶切后一一連接，得到供體載體。表1構(gòu)建供體載體所需引物序列及對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)引物名稱引物序列酶切位點(diǎn)Mcpip1LA-FCCGCTCGAGCTTCTGGTTTTGCTTGCTGAXhoIMcpip1LA-RATGGACGTCGAGGGGGAGGGTCGGGCCATTTGCAACAatIIMcpip1M-FTCTACCGGTTACGTGGGGAGCCAGTGTAgeIMcpip1M-RCCGGAATTCTTAGGGCCAAGCCCTTTACCEcoRIMcpip1RA-FCGACGCGTGTTACTCAGGTAAGGGCTTCAAGMluIMcpip1RA-RATAAGAATGCGGCCGCAGAGAGCCACCTAGGAACGANotI4）打靶載體的轉(zhuǎn)錄：對(duì)CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個(gè)部分（負(fù)責(zé)切割作用的Cas9蛋白和引導(dǎo)Cas9蛋白定位到靶位點(diǎn)的gRNA）分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。對(duì)于Cas9蛋白，將其表達(dá)載體pST1374-Cas9（Addgene44758）用PmeI進(jìn)行酶切，以純化后回收線性化質(zhì)粒為轉(zhuǎn)錄模板，用T7mMESSAGEmMACHINE試劑盒（AM1345，Ambion）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得加帽的mRNA產(chǎn)物。并用Poly(A)Tailing試劑盒（Ambion）對(duì)上述產(chǎn)物加尾，獲得成熟的mRNA產(chǎn)物；對(duì)于sgRNA，使用MEGAshortscript?Kit（AM1354，Ambion公司）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit（Qiagen，217084）進(jìn)行純化。5）Mcpip1-floxed條件性敲除小鼠的制作將上述成熟的mRNA產(chǎn)物與供體質(zhì)粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內(nèi)進(jìn)行培育。得到的小鼠進(jìn)行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過(guò)PCR方法篩選陽(yáng)性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機(jī)挑選一只作為F0代進(jìn)行后續(xù)的繁殖，最終獲得Mcpip1-floxed純合小鼠。6）肝細(xì)胞特異性Mcpip1基因敲除小鼠的制作將上述Mcpip1-floxed小鼠與肝臟特異性Alb-Cre（購(gòu)自TheJacksonLaboratory，貨號(hào)003574）轉(zhuǎn)基因小鼠交配，篩選得到Mcpip1floxed/floxed/Alb-Cre小鼠，待該小鼠長(zhǎng)至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen，誘導(dǎo)Cre酶的表達(dá)，Cre酶特異性的識(shí)別兩個(gè)同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個(gè)loxp，最后得到肝細(xì)胞特異性Mcpip1基因敲除小鼠。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝細(xì)胞特異性Mcpip1基因敲除小鼠肝臟中Mcpip1蛋白的表達(dá)量。提取肝臟、心臟、腦組織、腎臟組織蛋白，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），驗(yàn)證Mcpip1表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖1B。在小鼠心臟、腦、腎臟組織中，WT型小鼠和基因敲除小鼠Mcpip1蛋白表達(dá)含量變化不大；而在肝臟組織中，相比于WT型小鼠，基因敲除小鼠Mcpip1蛋白表達(dá)含量明顯降低，且在肝細(xì)胞中Mcpip1蛋白幾乎不表達(dá)。（2）肝細(xì)胞特異性Mcpip1轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建（構(gòu)建策略見(jiàn)圖2A）以野生型C57BL/6小鼠Mcpip1基因cDNA為模板，用上游引物（5’-AGCTTTGTTTAAACGCCACCATGAGTGACCCTTGTGGAACGA-3’）、下游引物（5’-CTAGCTAGCTTACTCACTGAGGTGCTGGGACT-3’）擴(kuò)增小鼠Mcpip1基因（NCBI，GeneID：230738，NM_153159.2），把擴(kuò)增得到的產(chǎn)物以及pCAG-CAT-LacZ載體（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院楊青林老師實(shí)驗(yàn)室，制備過(guò)程參見(jiàn)參考文獻(xiàn)：KimT,ZhelyabovskaO,LiuJ,etal.GenerationofanInducible,Cardiomyocyte-SpecificTransgenicMouseModelwithPPARb/dOverexpression[J].PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptors(PPARs),57.）用PmeI（NEB，#R0560L）和NheI（NEB，#R0131L）雙酶切后連接，得到轉(zhuǎn)基因載體pCAG-loxP-CAT-loxP-Mcpip1-hGHpA，Mcpip1的表達(dá)由CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)得到。將構(gòu)建的載體通過(guò)顯微注射構(gòu)造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到Mcpip1-floxed轉(zhuǎn)基因小鼠。肝細(xì)胞特異性Mcpip1轉(zhuǎn)基因小鼠由Mcpip1-floxed轉(zhuǎn)基因小鼠和Alb-Cre（購(gòu)自TheJacksonLaboratory，貨號(hào)003574）小鼠雜交繁殖得到。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中Mcpip1蛋白的表達(dá)量。提取不同轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織蛋白，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），驗(yàn)證Mcpip1過(guò)表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖2B。相比于野生型小鼠，肝細(xì)胞特異性Mcpip1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織中Mcpip1蛋白表達(dá)含量顯著提高。實(shí)施例2小鼠肝缺血再灌注損傷模型（ischemia/reperfusioninjury，I/R）的獲得（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：雄性C57BL/6品系野生型小鼠、肝細(xì)胞特異性Mcpip1基因敲除小鼠及Mcpip1轉(zhuǎn)基因小鼠、非轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)肝臟缺血再灌注建立肝缺血/再灌注（I/R）模型。隨機(jī)分為8組：C57BL/6J品系野生型小鼠假手術(shù)組（WTSham）及I/R手術(shù)組（WTI/R）、肝細(xì)胞特異性Mcpip1基因敲除小鼠假手術(shù)組（LKOSham）及I/R手術(shù)組（LKOI/R）、非轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組（NTGSham）及I/R手術(shù)組（NTGI/R）、Mcpip1轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組（TGSham）及I/R手術(shù)組（TGI/R）。（2）肝缺血再灌注損傷I/R模型手術(shù)（采用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉中葉和左葉的門靜脈和肝動(dòng)脈，使約70%的肝臟缺血）操作流程：1）手術(shù)前12h給小鼠禁食，可自由飲水。2）手術(shù)前用3%戊巴比妥鈉成功麻醉小鼠后，將其平臥固定肢體，用剃毛器將小鼠腹部術(shù)區(qū)毛刮凈，用10%碘酒和75%乙醇對(duì)術(shù)區(qū)消毒。3）取腹正中切口進(jìn)腹，暴露肝臟左、中葉之肝蒂。4）用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉中葉和左葉的門靜脈和肝動(dòng)脈，使約70%的肝臟缺血，以防止發(fā)生嚴(yán)重腸系膜靜脈淤血。0.5min后，與非阻斷的右葉相比，可見(jiàn)阻斷葉變白，說(shuō)明阻斷成功。此時(shí)，注意記錄缺血開始時(shí)間，維持缺血約60分鐘，期間用濕的鹽水紗布覆蓋切口，并注意小鼠的保溫（Sham組的小鼠在阻斷成功即刻去除血管夾，恢復(fù)缺血肝血流）。5）缺血60分鐘后去除血管夾，恢復(fù)缺血的肝臟血流，然后關(guān)閉腹腔，分兩層關(guān)腹，先把內(nèi)層縫好，再縫皮，將手術(shù)后的小鼠置于干凈的籠子中單獨(dú)飼養(yǎng)，觀察。實(shí)施例3肝臟壞死面積及肝功能指標(biāo)（AST，ALT）的測(cè)定肝臟缺血再灌注損傷嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)主要包括肝臟壞死面積和肝功能指標(biāo)（AST，ALT），這些指標(biāo)均與肝臟缺血再灌注損傷嚴(yán)重程度正相關(guān)。（1）取材分別于術(shù)后1h、3h、6h、24h取假手術(shù)組（Sham）以及缺血/再灌注組小鼠，頸椎脫臼處死，立即自下腔靜脈取血1mL，分離血清。同時(shí)統(tǒng)一取缺血區(qū)肝左葉組織大小約1.5cm×1cm×0.2cm于10%中性福爾馬林中固定24h后脫水，包埋，進(jìn)行石蠟切片后進(jìn)行HE染色。分離血清：收集血液的EP管于室溫下靜置1-2h使血液自然凝固。4℃、4000rpm/min離心30min，充分分離血清。用微量移液器分別吸取血清20μL、20μL、30μL、30μL置0.2mL無(wú)菌EP管中，對(duì)EP管進(jìn)行標(biāo)記，隨后保存于-80℃冰箱備用。（2）制備石蠟標(biāo)本切片1）主要操作程序包括：包埋框處理→流水沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→攤片→晾干或烘烤后備用。2）用石蠟切片機(jī)的標(biāo)準(zhǔn)程序切5μm的石蠟切片備用。（3）HE染色主要步驟為：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→雙蒸水1min→蘇木素溶液5min→水洗1min→1%鹽酸酒精1-3s→水洗1min→Scott液（碳酸氫鈉0.35g，硫酸鎂2g，蒸餾水100mL）1min→水洗1min→伊紅溶液3-5min→蒸餾水洗去浮色→70%酒精1s→95%酒精1s→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，顯微鏡拍照。（4）小鼠血清ALT、AST含量測(cè)定1）從-80℃冰箱中取出血清樣本，迅速置于冰上，在室溫下待樣品融化；2）在室溫下，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，讓EP管壁的血清聚集至管底。3）按照操作流程，打開全自動(dòng)生化分析儀（Sysmex，Chemix180i），清洗加樣器。4）按照全自動(dòng)生化分析儀樣品盤的標(biāo)記順序，逐一放入待測(cè)的EP管。5）準(zhǔn)確安裝試劑檢測(cè)盤，開始使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST水平。WT和Mcpip1-LKO組在肝臟缺血再灌注損傷后的HE染色結(jié)果見(jiàn)圖3A：顯微鏡下可見(jiàn)Sham組肝組織基本正常，肝組織結(jié)構(gòu)整齊，無(wú)明顯的纖維組織增生。I/R組隨著再灌注的時(shí)間的延長(zhǎng)，肝組織結(jié)構(gòu)模糊，排列紊亂。其內(nèi)有大小不等、形狀不規(guī)則的壞死灶，壞死灶內(nèi)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，排列紊亂，離斷，與正常肝臟比較，壞死肝臟的肝小葉內(nèi)見(jiàn)大片壞死灶，壞死組織邊緣可見(jiàn)炎性反應(yīng)帶，肝細(xì)胞核發(fā)生典型的壞死改變，可見(jiàn)核固縮。這種現(xiàn)象在缺血再灌注后24h達(dá)到高峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予Mcpip1-LKO小鼠I/R后的梗死面積明顯大于WT組小鼠（圖3A）；相反地，Mcpip1-TG小鼠I/R后的梗死面積明顯小于NTG組小鼠（圖3B），因此，Mcpip1在肝臟缺血再灌注引起的損傷中起到重要作用。血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明在I/R組各時(shí)間點(diǎn)ALT、AST水平均明顯高于Sham組，在再灌注后6h達(dá)到高峰，隨后下降，Mcpip1-LKO小鼠I/R后的ALT、AST水平明顯高于WT組小鼠（圖4A）；Mcpip1-TG小鼠I/R后的ALT、AST水平顯著低于NTG組小鼠（圖4B）。實(shí)施例4缺血再灌注后肝細(xì)胞凋亡情況測(cè)定用TUNEL試劑盒染色檢測(cè)凋亡，TUNEL試劑盒：ApopTag?PlusInSituApoptosisFluoresceinDetectionKit（S7111，Chemicon）。具體過(guò)程為：1）將石蠟切片置于烤箱中，60℃烤片30分鐘；2）二甲苯，5分鐘×3次；3）100%乙醇，5分鐘×2次；95%乙醇，5分鐘；70%乙醇，5分鐘；4）ddH2O漂洗，5分鐘×2次；5）蛋白酶K37℃孵育15分鐘；6）PBS漂洗5min×2次；7）直接滴加EquilibrationBuffer于組織上（13μL/cm2），室溫孵育至少10s；8）棄去EquilibrationBuffer，滴加TdTEnzyme工作液（77μLReactionBuffer+33μLTdTEnzyme）于組織上（11μL/cm2），置濕盒于37℃孵育1h；9）將切片置于盛有Stop/WashBuffer工作液（1mLStop/WashBuffer+34mLddH2O）的染色缸中振蕩15s后室溫孵育10min（等待過(guò)程中，將適當(dāng)量的Anti-DigoxigeninConjugate吸出，至于EP管中，避光放置在室溫下，使其平衡至室溫）；10）PBS漂洗1min×3次；11）輕輕甩去組織多余殘留的液體，將組織周圍液體吸3滴加Anti-DigoxigeninFluorescein工作液（53%BlockingSolution+47%Anti-DigoxigeninConjugate）于組織上（13μL/cm2），置濕盒中室溫避光孵育30min；12）PBS漂洗2min×4次（每次換新的PBS）；13）SlowFadeGoldantifadereagentwithDAPI（Invitrogen，S36939）封片；熒光鏡下觀察，拍照。若需保存，于暗濕盒中4℃保存。通過(guò)TUNEL試劑盒檢測(cè)了各組小鼠I/R術(shù)后24小時(shí)肝細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖5所示，Mcpip1-LKO小鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯比野生型小鼠增加（圖5A），Mcpip1-TG小鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯比非轉(zhuǎn)基因小鼠降低（圖5B），這表明Mcpip1與肝細(xì)胞缺血再灌注時(shí)凋亡相關(guān)。這些結(jié)果表明，Mcpip1過(guò)表達(dá)可以抑制肝組織缺血再灌注損傷，且與肝細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。上述成果表明，Mcpip1轉(zhuǎn)基因小鼠在肝臟缺血再灌注引起的損傷中，小鼠肝臟壞死面積顯著減少，肝功能明顯改善，肝細(xì)胞凋亡數(shù)量也明顯減少。證明Mcpip1基因在肝臟缺血疾病模型中有著重要的保護(hù)作用。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>武漢大學(xué)<120>單核細(xì)胞趨化蛋白-1誘導(dǎo)蛋白1（Mcpip1）在肝缺血再灌注損傷中的應(yīng)用<130>1<160>14<170>PatentInversion3.5<210>1<211>25<212>DNA<213>Musmusculus<400>1ggcactggctccccacgtagagggg25<210>2<211>24<212>DNA<213>Musmusculus<400>2ggcccttacctgagtaacttaggg24<210>3<211>54<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>loxp1-F<400>3agcttgacgtcataacttcgtatagcatacattatagcaatttataccggtgat54<210>4<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>loxp1-R<400>4atcaccggtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatgacgtca50<210>5<211>52<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>loxp2-F<400>5gatcccttaagataacttcgtatagcatacattatagcaatttatacgcgta52<210>6<211>52<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>loxp2-R<400>6ctagtacgcgtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatcttaagg52<210>7<211>29<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>Mcpip1LA-F<400>7ccgctcgagcttctggttttgcttgctga29<210>8<211>36<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>Mcpip1LA-R<400>8atggacgtcgagggggagggtcgggccatttgcaac36<210>9<211>27<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>Mcpip1M-F<400>9tctaccggttacgtggggagccagtgt27<210>10<211>29<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>Mcpip1M-R<400>10ccggaattcttagggccaagccctttacc29<210>11<211>31<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>Mcpip1RA-F<400>11cgacgcgtgttactcaggtaagggcttcaag31<210>12<211>36<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>Mcpip1RA-R<400>12ataagaatgcggccgcagagagccacctaggaacga36<210>13<211>42<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>上游引物<400>13agctttgtttaaacgccaccatgagtgacccttgtggaacga42<210>14<211>32<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>下游引物<400>14ctagctagcttactcactgaggtgctgggact32當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3