本發(fā)明涉及一種氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒及其制備方法與應(yīng)用，屬于納米材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

自1985年Kroto等人發(fā)現(xiàn)C₆₀以來(lái)，富勒烯極大地推動(dòng)了納米科技的發(fā)展。隨著富勒烯工業(yè)生產(chǎn)的迅速發(fā)展以及基于富勒烯材料的納米技術(shù)大量涌現(xiàn)，人們對(duì)于富勒烯及其衍生物效應(yīng)給予了極大的關(guān)注。富勒烯和內(nèi)嵌金屬富勒烯由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和化學(xué)物理性質(zhì)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有非常廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，富勒烯/金屬富勒烯具有抗病毒作用、抗氧化活性和細(xì)胞保護(hù)作用、抗菌活性、藥物/基因輸運(yùn)載體、磁共振成像和抑制腫瘤生長(zhǎng)等多方面的特性。但是由于富勒烯自身在水中難以溶解，這在很大程度上制約了其在生物領(lǐng)域的應(yīng)用。目前主要通過(guò)親水性高分子材料，如PEG、PVP等包覆或在碳籠表面修飾親水性基團(tuán)，如羥基、氨基等增加其在水中的溶解度。

目前，在金屬富勒烯碳籠表面修飾氨基酸可以在碳籠上引入羧基等官能團(tuán)，作為后續(xù)生物應(yīng)用的中間體，而且據(jù)報(bào)道其本身也是一種良好磁共振成像造影劑。目前在碳籠表面修飾氨基酸的方法主要是用富勒烯的甲苯溶液與氨基酸的堿性水溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中用到有機(jī)溶劑不符合簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、綠色環(huán)保的主旨。因此，開(kāi)發(fā)一種綠色環(huán)保、簡(jiǎn)單易行的制備氨基酸修飾的富勒烯水溶性納米顆粒具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒及其制備方法與應(yīng)用，本發(fā)明納米顆粒能溶于水，其制備方法簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保。

本發(fā)明提供的氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒，它的結(jié)構(gòu)通式為metallofullerene-(OH)_x(Amino Acid)_y；

其中，metallofullerene為金屬富勒烯；

0≤x<50；0≤y<20；

Amino Acid為水溶性氨基酸。

上述結(jié)構(gòu)通式表示羥基和水溶性氨基酸均連接于金屬富勒烯上。

上述的納米顆粒中，所述金屬富勒烯包括；M@C_2n、M₂@C_2n、MA@C_2n、M₃N@C_2n、M₂C₂@C_2n、M₂S@C_2n、M₂O@C_2n和M_mA_3-mN@C_2n中的至少一種；其中，M、A均為金屬元素，所述M、A均選自Sc、Y和鑭系金屬元素中的至少一種，30≤n≤60，0≤m≤3，且n、m均為整數(shù)；

所述水溶性氨基酸為丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、精氨酸、賴氨酸和天門(mén)氨酸中的至少一種。

本發(fā)明中，鑭系金屬元素為鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(Pr)、釹(Nd)、钷(Pm)、釤(Sm)、銪(Eu)、釓(Gd)、鋱(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、鉺(Er)、銩(Tm)、鐿(Yb)、镥(Lu)；

所述稀土金屬具體可為Gd，所述金屬富勒烯具體可為Gd@C₈₂、Gd₃N@C₈₀。

上述的納米顆粒中，所述納米顆粒的水合粒徑可為1～1000nm，具體可為10～300nm。

本發(fā)明還提供了上述的納米顆粒的制備方法，包括如下步驟：將所述水溶性氨基酸的堿溶液與所述金屬富勒烯混合，進(jìn)行親核加成反應(yīng)，即得到所述氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒。

本發(fā)明中，所述金屬富勒烯是用高效液相色譜結(jié)合富勒烯/內(nèi)嵌金屬富勒烯專用色譜柱Buckyprep/Buckyprep-M純化得到的。

本發(fā)明制備方法同樣適用于空心富勒烯，即將所述金屬富勒烯用空心富勒烯替換進(jìn)行反應(yīng)；所述空心富勒烯包括C₆₀或C₇₀。

上述的制備方法中，所述水溶性氨基酸的堿溶液中堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可為10～50％，具體可為14％或10～30％；所述水溶氨基酸與所述堿的摩爾比可為1：1～10，具體可為1：2或1：1～8；所述水溶性氨基酸的堿溶液使用的堿溶液具體可為氫氧化鈉溶液和/或氫氧化鉀溶液；

所述水溶性氨基酸與所述金屬富勒烯的摩爾比可為1～1000：1，具體可為1000：1或50～1000：1。

上述的制備方法中，所述親核加成反應(yīng)的溫度可為50～100℃，具體可為50℃；所述親核加成反應(yīng)的時(shí)間可為1～48h，具體可為1.5h、2h、4h、24h、1.5～24h或1～30h。

上述的制備方法中，在所述親核加成反應(yīng)之后還包括過(guò)濾除去雜質(zhì)的步驟。

本發(fā)明中，所述過(guò)濾除去雜質(zhì)具體包括：先過(guò)濾除去未反應(yīng)的所述金屬富勒烯固體顆粒，然后用透析袋透析除去未反應(yīng)的所述水溶性氨基酸，再用微孔濾膜過(guò)濾；具體使用Mw＝3500透析袋透析除去小分子雜質(zhì)(具體為水溶性氨基酸和堿)、220nm微孔濾膜過(guò)濾。

本發(fā)明制備的水溶性富勒烯納米顆粒，表面修飾的羧基殘基便于進(jìn)一步與生物配體偶聯(lián)，為后續(xù)生物應(yīng)用提供了更多的可能。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明通過(guò)固液法制備的metallofullerene-(OH)_x(Amino Acid)_y；0≤x<50；0≤y<20具有水溶性。

2、本發(fā)明不需有機(jī)溶劑的介入，無(wú)需分離中間產(chǎn)物，無(wú)需無(wú)水無(wú)氧等條件，具有制備方法簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。

3、本發(fā)明巧妙利用氨基酸中氨基的親核性，經(jīng)過(guò)一步反應(yīng)大量制得氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒。本發(fā)明制備方法同樣適用于C₆₀、C₇₀等空心富勒烯，Y₃N@C₈₀、Lu₃N@C₈₀等內(nèi)嵌富勒烯；以及賴氨酸、甘氨酸、精氨酸、絲氨酸、天門(mén)冬氨酸等水溶性氨基酸，因而，具有一定普適性和便于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

4、本發(fā)明制備的metallofullerene-(OH)_x(Amino Acid)_y金屬富勒烯納米顆粒具有粒徑分布小、窄等特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆熱重分析熱重及微商熱重曲線。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆的紅外光譜圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆的紫外-可見(jiàn)吸收譜圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1所制備的金屬富勒烯Gd@C₈₂納米顆粒Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7時(shí)平均水合半徑。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1所制備的金屬富勒烯Gd@C₈₂納米顆粒Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7時(shí)Zeta電位。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1所制備的金屬富勒烯Gd@C82納米顆粒在0.5T磁場(chǎng)下用反轉(zhuǎn)-恢復(fù)序列測(cè)得的縱向弛豫時(shí)間的倒數(shù)1/T1對(duì)不同Gd濃度作圖。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例2和3所制備的金屬富勒烯Gd@C₈₂不同氨基酸納米顆粒在pH＝7時(shí)平均水合半徑。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例4所制備的空心富勒烯C₇₀納米顆粒C₇₀(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆的熱重及微商熱重曲線。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例4所制備的空心富勒烯C₇₀納米顆粒C₇₀(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7時(shí)平均水合半徑。

圖10為本發(fā)明實(shí)施例5所制備的空心富勒烯C₆₀的β-丙氨酸納米顆粒在pH＝7時(shí)平均水合半徑。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中，金屬富勒烯(M@C_2n)是用高效液相色譜結(jié)合富勒烯/內(nèi)嵌金屬富勒烯專用色譜柱Buckyprep/Buckyprep-M純化得到的。

實(shí)施例1、

把約10mg Gd@C₈₂固體加入10ml單口瓶中，加入6mlNaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14％的β-丙氨酸堿溶液(氨基酸與氫氧化鈉的摩爾比具體為1：2；β-丙氨酸與Gd@C₈₂的摩爾比為1000：1)，50℃下劇烈攪拌1.5h，黑色固體逐漸溶解生成棕黑色溶液。過(guò)濾除去未反應(yīng)的少量固體粉末，濾液使用Mw＝3500透析袋透析除去小分子雜質(zhì)，使用220nm微孔濾膜過(guò)濾后得到的棕黑色溶液即為本發(fā)明的氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆。

表1β-丙氨酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒元素分析結(jié)果

對(duì)本發(fā)明β-丙氨酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒進(jìn)行元素分析所得碳、氮、氫元素比，如表1所示。由表1可知，根據(jù)熱重曲線分析可以得出原固體粉末中含10.9％的水，經(jīng)過(guò)計(jì)算約為13個(gè)H₂O分子(如圖1)，再結(jié)合元素分析，進(jìn)一步推測(cè)得到該物質(zhì)的平均分子式為Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆。

圖2為紅外光譜在3300cm^-1左右的強(qiáng)的吸收峰歸屬為O-H的伸縮振動(dòng)，在1740和1630cm^-1處中等的吸收峰歸屬為C＝O的伸縮振動(dòng)、N-H的彎曲振動(dòng)，在1568，1400和1300cm^-1處的強(qiáng)峰分別為C＝C的伸縮振動(dòng)、)O-H的彎曲振動(dòng)以及C-O、C-N的伸縮振動(dòng)峰。由圖2可知，本發(fā)明β-丙氨酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒中含有上述的親水基團(tuán)，即本發(fā)明是水溶性。

由圖3可知，本發(fā)明Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在400nm波長(zhǎng)以內(nèi)有強(qiáng)吸收。

由圖4可知，本發(fā)明Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7的水中平均粒徑為127.7±0.5nm。

由圖5可知，本發(fā)明Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7的水中Zeta電位為-44.7mV。

由圖6可知，本發(fā)明Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在0.5T磁場(chǎng)下縱向弛豫率r₁為65.53mM^-1s^-1，是臨床使用Gd－DTPA的10倍以上。

實(shí)施例2、

用經(jīng)過(guò)提純的10mg Gd@C₈₂固體與6mL NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14％的L-賴氨酸堿溶液(L-賴氨酸與NaOH的摩爾比為1:2)混合，50℃下劇烈攪拌2h，黑色固體逐漸溶解生成棕黑色溶液，其余條件同本發(fā)明實(shí)施例1。

實(shí)施例3、

用經(jīng)過(guò)提純的10mg Gd@C₈₂固體與6mL NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14％的L-絲氨酸堿溶液(L-絲氨酸與NaOH的摩爾比為1:2)混合，50℃下劇烈攪拌4h，黑色固體逐漸溶解生成棕紅色溶液，其余條件同本發(fā)明實(shí)施例1。

如圖7所示，為Gd@C₈₂不同氨基酸納米顆粒在pH＝7的水中的粒徑分布曲線。由圖7和表2可知，賴氨酸反應(yīng)產(chǎn)物的平均粒徑最小，分布最寬；絲氨酸反應(yīng)產(chǎn)物的平均粒徑最大，分布最窄。

表2 Gd@C₈₂不同氨基酸納米顆粒在pH＝7的水中的平均粒徑及Z電勢(shì)

實(shí)施例4、

用經(jīng)過(guò)提純的10mg C₇₀固體與6ml NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14％的β-丙氨酸堿溶液(β-丙氨酸與NaOH的摩爾比為1:2)混合，50℃下劇烈攪拌24h，黑色固體逐漸溶解生成棕紅色溶液，其余條件同本發(fā)明實(shí)施例1。

表3 C₇₀(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆元素分析結(jié)果

由圖8和表3可知，由熱重曲線分析推測(cè)出原固體粉末中含11.0％的水，經(jīng)過(guò)計(jì)算約為14個(gè)H₂O分子(如圖8)，經(jīng)推算，該納米顆粒的平均分子式為C₇₀(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆。

由圖9說(shuō)明C₇₀(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7的水中平均粒徑為139.8±0.8nm。

實(shí)施例5、

用經(jīng)過(guò)提純的10mg C₆₀固體與6mlNaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14％的β-丙氨酸堿溶液(β-丙氨酸與NaOH的摩爾比為1:2)混合，50℃下劇烈攪拌24h，黑色固體逐漸溶解生成棕紅色溶液，其余條件同本發(fā)明實(shí)施例1。

由圖10說(shuō)明空心富勒烯C₆₀的β-丙氨酸納米顆粒在pH＝7時(shí)平均水合半徑為139.8±1.0nm。