本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種干擾素調(diào)節(jié)因子6(interferon regulatory factor-6，IRF6)作為藥物靶標(biāo)在篩選治療血管損傷后再狹窄的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著人類社會經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展、人民生活水平的提高以及人口老齡化進(jìn)程的加快，心血管疾病的發(fā)病率逐年升高，已成為嚴(yán)重危害全球性公眾健康的重大疾病之一，目前對這類疾病尚無根治辦法。血管外科的治療手段包括球囊擴(kuò)張、支架置入及動脈旁路等方式，但是血管重建后再狹窄極大地影響了治療效果。有關(guān)血管再狹窄的研究已進(jìn)行了多年，但是迄今為止還沒有明確。已有研究表明，在損傷形成的過程中，新生內(nèi)膜及中膜組織過度增生以及同時伴隨的細(xì)胞外基質(zhì)形成，是造成血管重建后再狹窄的主要病理基礎(chǔ)。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的兩種不同的表型狀態(tài)，即分化/收縮型和去分化/合成型的轉(zhuǎn)化在新生內(nèi)膜形成過程中扮演著重要的角色。其由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化時，增殖、遷移能力增強(qiáng)并分泌、合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，從而形成新生內(nèi)膜，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的血管增生性疾病的發(fā)生。因此，尋找新的血管再狹窄的干預(yù)靶點具有重要的理論意義。

哺乳動物體內(nèi)，干擾素調(diào)節(jié)因子家族(IRFs)是由9個家族成員組成(IRF1-IRF9)，目前的研究公認(rèn)其為免疫和細(xì)胞存活的主要調(diào)節(jié)因子[1-3]。與其他IRF成員不同之處，IRF6的功能研究都集中在表皮發(fā)育和分化的調(diào)節(jié)作用，而其對免疫細(xì)胞的影響仍然未知[4]。有2個主要IRF6缺陷小鼠模型得到發(fā)現(xiàn)：其中一個為在翼狀胬肉綜合征病人身上發(fā)現(xiàn)的，敲除最常見的IRF6蛋白突變(R84C)[5]，另一個是功能完全缺失的等位基因[4]。IRF6功能無論是部分或完全缺失都能導(dǎo)致肢體和皮膚發(fā)育嚴(yán)重缺陷以及在濾泡間上皮角質(zhì)細(xì)胞妥協(xié)的增殖與分化[4,5]。除了翼狀胬肉綜合征，IRF6的突變也已與另一常染色體顯性遺傳疾病，范德伍茲綜合征相關(guān)，其特征是唇裂，指畸形，皮膚皺褶，和生殖器異常[6]。在這些綜合征里，DeltaNp63亞型p63和正性激活I(lǐng)RF6表達(dá)的IRF6增強(qiáng)劑之間的相互作用已經(jīng)建立，導(dǎo)致了p63水平的負(fù)調(diào)節(jié)和隨后抑制角質(zhì)細(xì)胞的增殖[7]。

參考文獻(xiàn)

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2.Ikushima，H.，Negishi，H.&Taniguchi，T.The IRF family transcription factors at the interface of innate and adaptive immune responses.Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.78，105–116(2013).

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5.Richardson RJ,Dixon J,Malhotra S,Hardman MJ,Knowles L,Boot-Handford RP,Shore P,Whitmarsh A,Dixon MJ(2006)Irf6is a key determinant of the keratinocyte proliferation-differentiation switch.Nat Genet 38:1329-1334doi:10.1038/ng1894

6.Kondo S,Schutte BC,Richardson RJ,Bjork BC,Knight AS,Watanabe Y,Howard E,de Lima RL,Daack-Hirsch S,Sander A,McDonald-McGinn DM,Zackai EH,Lammer EJ,Aylsworth AS,Ardinger HH,Lidral AC,Pober BR,Moreno L,Arcos-Burgos M,Valencia C,Houdayer C,Bahuau M,Moretti-Ferreira D,Richieri-Costa A,Dixon MJ,Murray JC(2002)Mutations in IRF6cause Van der Woude and popliteal pterygium syndromes.Nat Genet 32:285-289doi:10.1038/ng985

7.Moretti F,Marinari B,Lo Iacono N,Botti E,Giunta A,Spallone G,Garaffo G,Vernersson-Lindahl E,Merlo G,Mills AA,Ballaro C,Alema S,Chimenti S,Guerrini L,Costanzo A(2010)A regulatory feedback loop involving p63and IRF6links the pathogenesis of 2genetically different human ectodermal dysplasias.J Clin Invest 120:1570-1577doi:10.1172/JCI40267

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于確定IRF6的表達(dá)和血管損傷后再狹窄的相互關(guān)系，提供一種IRF6作為藥物靶標(biāo)在篩選防治血管損傷后再狹窄的藥物中的應(yīng)用，進(jìn)而提供一種IRF6的抑制劑在制備防治血管損傷后再狹窄的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

本發(fā)明以野生型C57BL/6小鼠與IRF6基因敲除小鼠(IRF6-KO小鼠)為實驗對象，通過頸動脈導(dǎo)絲損傷模型誘導(dǎo)獲得小鼠血管損傷模型(vascular injury,VI)，進(jìn)行了血管損傷模型(VI)小鼠內(nèi)膜新生測定、血管壁細(xì)胞增殖水平的檢測和平滑肌細(xì)胞表型的檢測和研究，結(jié)果表明：與野生型C56BL/6小鼠對比，IRF6基因敲除小鼠表現(xiàn)出內(nèi)膜新生及細(xì)胞增殖明顯小于WT小鼠；IRF6基因敲除可以抑制細(xì)胞增殖核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)和細(xì)胞周期蛋白(Cyclin D1)的表達(dá)，可抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和內(nèi)膜增生；IRF6基因敲除可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞分化特異性抗原(smoothelin)、平滑肌肌動蛋白(Smooth Muscle Actin,SMA)和平滑肌22α(smooth muscle 22alpha，SM22α)的表達(dá)，可抑制平滑肌細(xì)胞由收縮型向合成型的表型轉(zhuǎn)換，從而抑制內(nèi)膜增生。上述結(jié)果表明IRF6基因敲除會抑制血管損傷后再狹窄的發(fā)生，IRF6能夠促進(jìn)血管損傷后再狹窄的形成，為研究預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的新靶點和新策略提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。

因此，IRF6基因可作為藥物靶點，構(gòu)建IRF6基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動物模型，用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的藥物；IRF6基因也可作為基因治療中的靶基因，設(shè)計并制備預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的目的。例如以IRF6為靶基因，設(shè)計可干擾IRF6表達(dá)的雙鏈siRNA，通過化學(xué)方法合成以后，注射入人體通過RNA干擾的方法使IRF6基因沉默來治療血管損傷后再狹窄；還可以設(shè)計并構(gòu)建IRF6的突變體，注射后進(jìn)入細(xì)胞，競爭IRF6原形的作用底物，從而抑制IRF6的功能，起到治療目的；此外，還可以以IRF6為靶點設(shè)計小分子化合物抑制劑，利用IRF6基因過表達(dá)的體外模型或動物模型，通過篩選，發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性抑制IRF6的分子，從而為血管損傷后再狹窄的治療提供新的治療性分子。

針對IRF6的上述功能，提供IRF6作為藥物靶標(biāo)在篩選治療血管損傷后再狹窄的藥物中的應(yīng)用。

針對IRF6的上述功能，提供IRF6的抑制劑在制備血管損傷后再狹窄的藥物中的應(yīng)用。

一種保護(hù)血管功能的藥物，包含IRF6的抑制劑。

一種治療血管損傷后再狹窄的藥物，包含IRF6的抑制劑。

一種預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的動脈支架，其包被有IRF6的抑制劑。

所述的IRF6的抑制劑優(yōu)選為IRF6基因的siRNA、IRF6基因的RNA干擾載體，IRF6的抗體及其他能夠抑制IRF6表達(dá)的抑制劑。

在本發(fā)明中，所述血管損傷主要是動脈血管損傷。

在本發(fā)明中，所述血管損傷是指動脈粥樣硬化引起的血管損傷，或者在治療動脈粥樣硬化時引起的血管損傷，例如通過球囊擴(kuò)張或放入支架引起的血管損傷，或者移植后動脈病或肺動脈高壓引起的血管損傷。

在本發(fā)明中，所述動脈粥樣硬化既包括動脈粥樣硬化較早期階段的血管狹窄期，也包括動脈粥樣硬化嚴(yán)重時的血管梗塞期。

在本發(fā)明中，所述動脈支架是指用于支撐人體內(nèi)因病變而狹窄、閉塞的血管，恢復(fù)血液流通的管狀器件，采用金屬或高分子材料加工制成，可長期或暫時留于人體血管內(nèi)。在管腔球囊擴(kuò)張成形的基礎(chǔ)上，在病變段置入支架以達(dá)到支撐狹窄閉塞段血管、減少血管彈性回縮及再塑形、保持管腔血流通暢的目的，既包括外周動脈支架，也包括冠狀動脈支架。

在本發(fā)明中，所述再狹窄是指在局部血管發(fā)生損傷時，所作出的導(dǎo)致血管管腔再狹窄的普遍性生物學(xué)反應(yīng)。這里主要指醫(yī)源性損傷引起的血管再狹窄，損傷過程主要由動脈重塑和內(nèi)皮增生組成。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)IRF6的新功能，即IRF6具有惡化血管損傷后再狹窄的作用。

(2)基于IRF6在惡化血管損傷后再狹窄中的功能，其為研制預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的藥物提供靶標(biāo)。

(3)IRF6的抑制劑可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的藥物。

(4)IRF6的抑制劑可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療血管損傷后再狹窄的動脈支架。

附圖說明

圖1是WT和IRF6-KO小鼠術(shù)后14、28天的EVG染色及內(nèi)膜面積結(jié)果統(tǒng)計柱狀圖；

其中，A：EVG染色圖，B：內(nèi)膜面積統(tǒng)計柱狀圖(*：p＜0.05vs WT VI組)。

圖2是WT和IRF6-KO小鼠術(shù)后14、28天血管壁細(xì)胞增殖水平標(biāo)志物PCNA、CyclinD1表達(dá)的免疫熒光染色及結(jié)果統(tǒng)計柱狀圖；

其中，A：免疫熒光染色，B：結(jié)果統(tǒng)計柱狀圖(*：p＜0.05vs WT VI組)。

圖3是WT和IRF6-KO小鼠術(shù)后14、28天平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換標(biāo)志物smoothelin、SMA、SM22α表達(dá)的免疫熒光染色及結(jié)果統(tǒng)計柱狀圖；

其中，A：免疫熒光染色，B：柱狀圖(*：p＜0.05vs WT VI組)。

具體實施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

實驗用動物及飼養(yǎng)

實驗動物：選用8-10周齡、體重在24-27g，雄性，C57BL/6小鼠(WT小鼠，購自北京華阜康生物科技有限公司)，IRF6基因敲除小鼠(IRF6-KO，購自美國The Jackson Laboratory公司，貨號：016902)。

飼養(yǎng)環(huán)境：所有實驗小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)SPF級實驗動物中心。SPF級小鼠飼料購自北京華阜康生物科技有限公司，飼養(yǎng)條件：室溫在22-24℃之間，濕度在40-70％之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水?dāng)z食。

【實施例1】小鼠血管損傷模型(VI)獲得

1.實驗動物分組：使用8-10周齡，體重24-27g的WT和IRF6-KO小鼠，共分為2組：WT血管損傷組，IRF6-KO血管損傷組，每組各20只小鼠。分別在手術(shù)后14天和28天處死小鼠，取損傷節(jié)段血管進(jìn)行分析。

2.小鼠血管損傷模型操作流程：

1)用電子天平于動態(tài)模式下準(zhǔn)確稱取小鼠體重(g)，用雙蒸水準(zhǔn)確配置3％戊巴比妥鈉溶液，輕輕搖動使其充分溶解，采用80mg/kg體重劑量，計算所需戊巴比妥鈉溶液體積后用1mL注射器準(zhǔn)確抽取相應(yīng)體積溶液，行腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠充分麻醉倒(約3min)后，8％硫化鈉頸部脫毛。

2)分離頸內(nèi)和頸外動脈。

3)在頸內(nèi)動脈和頸外動脈分叉處用8-0線結(jié)扎頸外動脈，同時用血管夾(WPI,501784-G)暫時性阻斷頸內(nèi)動脈及頸總動脈供血。

4)用顯微剪(WPI,501839)在頸外動脈結(jié)扎線的上方橫向剪一個小口。經(jīng)此血管切口插入直徑0.015英寸的導(dǎo)絲(No.C-SF-15-15,Cook,Bloomington,Indiana)，旋轉(zhuǎn)導(dǎo)絲進(jìn)退5-6次。

5)在切口進(jìn)心端結(jié)扎頸外動脈，松開頸內(nèi)及頸總動脈置留的血管夾，剪斷線頭，清理術(shù)野，縫合頸部切口。

【實施例2】血管損傷模型(VI)小鼠內(nèi)膜新生測定

1.小鼠取材

1)麻醉小鼠，剪破心臟放血。

2)從頸動脈近分叉處剪下頸動脈，取0.5-0.6cm長，保留頸外動脈線結(jié)。

3)將頸動脈放入PBS中，用顯微鑷輕柔排干管腔內(nèi)的殘血。

4)將血管放入裝有1mL 4％多聚甲醛的1.5mL EP管中固定。

2.病理學(xué)檢測

2.1制備石蠟標(biāo)本切片

由實驗室專業(yè)病理工作人員制備石蠟標(biāo)本切片，主要操作程序包括：4％多聚甲醛中隔夜固定后，將血管用濾紙小心包好，放入包埋框→流水沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片(3μm)→攤片→晾干或烘烤后備用。

2.2EVG染色

主要步驟為：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精3min，2次→95％酒精3min，1次→70％酒精3min，1次→雙蒸水1min→高錳酸鉀溶液5min(珠海貝索，BA-4083B)→水洗1min→草酸溶液5min(珠海貝索，BA-4083B)→水洗1min→95％酒精分化2-3秒→Elastin染液(珠海貝索，BA-4083B)8-24小時→95％酒精迅速分化1s→流水沖洗10min→雙蒸水1min→Van Gieson染液(珠海貝索，BA-4083B)1min→95％酒精迅速分化2-3s→100％酒精2min，2次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，顯微鏡拍照。

以血管內(nèi)彈力纖維和外彈力纖維為界，內(nèi)彈力板以內(nèi)為血管內(nèi)膜，外彈力板以外為血管外膜，內(nèi)外彈力板之間為血管中膜。用Image-Pro Plus 6.0軟件分別圈各血管管腔面積。

內(nèi)膜面積大小的計算參照公式如下：

新生內(nèi)膜面積＝內(nèi)彈力板面積-管腔面積；

中膜面積＝外彈力板面積-內(nèi)彈力板面積。

小鼠EVG染色后的血管內(nèi)膜新生的結(jié)果如圖1。正常的血管壁結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，血管內(nèi)膜為單層內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)構(gòu)完整，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊。通過HE染色觀察到，血管損傷組(VI組)血管壁結(jié)構(gòu)不完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞缺失，新生內(nèi)膜增生明顯，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤；IRF6-KO組在術(shù)后14、28天新生內(nèi)膜面積明顯比WT小鼠要減小。同樣，內(nèi)膜面積/中膜面積的比值在VI術(shù)后IRF6-KO組要低于WT組。這說明IRF6基因的缺失可以抑制血管損傷后引起的內(nèi)膜新生。

【實施例3】血管壁細(xì)胞增殖水平的檢測

免疫熒光染色檢測細(xì)胞增殖核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin D1)的表達(dá)。所需一抗信息：PCNA(#2586；1:100；mouse；Cell Signaling Technology)，cyclin D1(#2978；1:25；rabbit；Cell Signaling Technology)；所需二抗信息：Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG(A11011；Invitrogen,Carlsbad,CA)，Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse IgG(A11004；Invitrogen,Carlsbad,150d,CA)。

主要步驟為：

1)烤片：將石蠟切片置于55℃烤箱中60min以上。

2)脫蠟：二甲苯8min×3。

3)水合：100％乙醇5min×2；95％乙醇5min；70％乙醇5min；ddH₂O浸洗5min×2。

4)檸檬酸鹽組織抗原修復(fù)(高壓修復(fù))：取一定量的pH6.0檸檬酸鹽抗原修復(fù)工作液(購自福州邁新生物科技有限公司，貨號MVS-0100)于修復(fù)盒中，修復(fù)工作液的量必須能足夠浸沒整張切片，將修復(fù)盒放入已加入適量自來水的高壓鍋中，大火加熱至沸騰，將脫蠟水合后的組織切片置于耐高溫染色架上，再將染色架緩慢放入修復(fù)盒中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣，開始計時5min后，壓力鍋斷開電源，去閥開蓋，取出修復(fù)盒；室溫放置20min自然冷卻后取出切片。

5)ddH₂O漂洗5min×2次，PBS漂洗5min×2次。

6)組化筆劃圈，滴加10％驢血清(GTX27481，GeneTex)封閉，于濕盒中37℃封閉60min。

7)棄封閉液，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，4℃孵育過夜，37℃復(fù)溫30min，棄去一抗，PBS洗8min×4次。

8)滴加二抗，于濕盒中37℃孵育60min，棄去二抗，PBS浸洗5min×4次。

9)SlowFade Gold antifade reagent with DAPI(S36939，Invitrogen)封片。

10)熒光鏡下觀察，拍照。若需保存，于暗濕盒中4℃保存。

熒光統(tǒng)計方法：PCNA免疫熒光染色統(tǒng)計采用IPP軟件計數(shù)，PCNA陽性細(xì)胞百分比＝PCNA陽性細(xì)胞個數(shù)/(內(nèi)膜+中膜)的總DAPI個數(shù)*100％；CyclinD1免疫熒光染色統(tǒng)計采用IPP軟件直接測陽性吸光度。

免疫熒光法觀察平滑肌細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA、CyclinD1在WT和IRF6-KO小鼠血管損傷后的表達(dá)變化，結(jié)果見圖2。PCNA、CyclinD1在血管組織中有表達(dá)，IRF6-KO小鼠在術(shù)后14、28天PCNA的陽性細(xì)胞個數(shù)及CyclinD1的熒光強(qiáng)度均要降低于同組的WT小鼠，表明IRF6基因敲除可以抑制PCNA、CyclinD1的表達(dá)，可抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和血管內(nèi)膜新生。

【實施例4】平滑肌細(xì)胞表型的檢測

免疫熒光染色檢測平滑肌細(xì)胞分化標(biāo)志物：平滑肌細(xì)胞分化特異性抗原(smoothelin)、平滑肌肌動蛋白(Smooth Muscle Actin，SMA)、平滑肌22α(smooth muscle 22alpha，SM22α)的表達(dá)。所需一抗信息：SMA(ab5694；1:100；rabbit；Abcam)and SM22α(ab14106；1:100；rabbit；Abcam)；所需二抗信息：Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG(A11008；Invitrogen,Carlsbad,CA)。

主要步驟參照實施例3。

熒光統(tǒng)計方法：采用IPP軟件直接測陽性吸光度。

在正常生理狀態(tài)下，血管平滑肌細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，主要表現(xiàn)為收縮型；血管損傷后，血管平滑肌細(xì)胞由中膜向內(nèi)膜遷移，平滑肌細(xì)胞的增殖凋亡失平衡，表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，血管壁不適重塑，從而引起內(nèi)膜增生。免疫熒光觀察smoothelin、SMA、SM22α在WT和IRF6-KO小鼠血管損傷后的表達(dá)變化，結(jié)果見圖3。smoothelin、SMA、SM22α在血管組織中有表達(dá)，IRF6-KO小鼠在術(shù)后14、28天smoothelin、SMA、SM22α的熒光強(qiáng)度均要高于同組的WT小鼠，表明IRF6基因敲除可以促進(jìn)smoothelin、SMA、SM22α的表達(dá)，可抑制平滑肌細(xì)胞由收縮型向合成型的表型轉(zhuǎn)換，從而抑制內(nèi)膜增生。

以上實施例結(jié)果顯示，野生型小鼠和IRF6-KO小鼠在血管損傷模型(VI)的誘導(dǎo)下均發(fā)生血管損傷后再狹窄。IRF6基因敲除小鼠的內(nèi)膜新生、細(xì)胞增殖水平以及平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換均比野生型小鼠不明顯。這些結(jié)果表明，IRF6可以加重血管損傷誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞的增殖、表型轉(zhuǎn)化和血管新生內(nèi)膜形成。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。