本發(fā)明涉及已知化合物的新應(yīng)用領(lǐng)域，具體地，涉及Manoalide在制備抑制新生血管形成藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

血管新生是指從已經(jīng)存在的毛細(xì)血管長出新的血管的生物學(xué)過程，它是一系列的生理、病理過程中非常重要的環(huán)節(jié)。在生理狀態(tài)下，如胚胎發(fā)育、傷口愈合以及月經(jīng)周期中卵巢、子宮的周期性變化都依賴于新生的血管提供氧氣、養(yǎng)料及帶走代謝的廢物。病理狀態(tài)下局部缺血的組織、心梗后再灌注，這時(shí)有明顯的血管新生，這種血管新生過程在治療中應(yīng)得到促進(jìn)以利于疾病的治療。相反地，腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、節(jié)段性回腸炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、銀屑病、子宮內(nèi)膜異位癥、肥胖癥等疾病將會(huì)從抑制血管新生方面達(dá)到治療疾病的效果。

目前抑制血管新生的藥物有貝伐單抗、恩度和反應(yīng)停、舒尼替尼（Sunitinib）；馬立馬司他（Marimastat）；TNP-470等，但是這些藥物有各自的局限性，如手足皮膚反應(yīng)、心血管毒性、腎毒性等副作用，可以增加致死性不良事件的風(fēng)險(xiǎn)。最常見的致死性不良事件為出血、心肌梗死、肝衰竭、高血壓和蛋白尿等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供了Manoalide在制備抑制新生血管形成藥物中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明要求保護(hù)Manoalide在制備抑制新生血管形成藥物中的應(yīng)用。

因?yàn)殡u胚絨毛尿囊膜（CAM）模型和雞胚卵黃囊膜（YSM）模型是本技術(shù)領(lǐng)域用于檢測(cè)或篩選對(duì)新生血管生成具有影響作用藥物的典型性和普適性模型，因此，本發(fā)明只需要在這兩種代表性模型中證明Manoalide可以抑制新生血管形成，就可以強(qiáng)有力的證實(shí)Manoalide可以用于制備抑制新生血管形成的藥物。

優(yōu)選地，本發(fā)明要求保護(hù)Manoalide在制備抑制腫瘤新生血管形成藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，本發(fā)明要求保護(hù)Manoalide在制備抑制乳腺癌腫瘤新生血管形成藥物中的應(yīng)用。

一種抑制新生血管形成的藥物，含有Manoalide和藥學(xué)上可接受的輔劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)Manoalide可以抑制雞胚絨毛尿囊膜模型中二級(jí)及三級(jí)血管的形成，并可以抑制雞胚卵黃囊膜模型中血管的生長。另外，在雞胚絨毛尿囊膜上種植乳腺癌腫瘤細(xì)胞(MDA-MB-231)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在雞胚絨毛尿囊膜上生長并形成腫瘤，腫瘤內(nèi)部出現(xiàn)新生血管，用Manoalide處理后，此藥可以顯著抑制腫瘤內(nèi)部新生血管形成和腫瘤細(xì)胞的生長，由此證明Manoalide可抑制新生血管形成，可以用于制備抑制新生血管形成的藥物，該藥物可以廣泛用于新生血管相關(guān)疾?。ㄈ缒[瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、節(jié)段性回腸炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、銀屑病、子宮內(nèi)膜異位癥、肥胖癥等）。尤其是腫瘤的血管新生，為臨床靶向血管新生治療腫瘤具有重要的意義。

附圖說明

圖1為藥物處理雞胚絨毛尿囊膜模型后的觀察結(jié)果。

圖2為藥物處理雞胚卵黃囊膜模型后的觀察結(jié)果。

圖3為藥物處理雞胚絨毛尿囊膜種腫瘤細(xì)胞后的觀察結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實(shí)施例1

雞胚絨毛尿囊膜（CAM）模型的建立及藥物處理

1）雞胚處理：將購買的9天雞胚表面清潔，然后用1∶1 000新潔爾滅液擦拭，拭干后將雞胚氣室向上，長軸與蛋托呈45°放入普通培養(yǎng)箱中孵化，設(shè)定溫度(37.8 ±0.5)℃和相對(duì)濕度60%，每天照蛋轉(zhuǎn)蛋3次。

2）開窗：孵育第9天，在照蛋器下標(biāo)記氣室，確定開窗位置，用75%酒精消毒后，用慢速牙科鉆在氣室標(biāo)記處鉆一個(gè)1mm³大小的小孔，用眼科彎鑷小心揭去蛋殼，形成直徑約為1cm的缺口，用眼科鑷輕輕揭掉蛋膜暴露雞胚絨毛尿囊膜。

3）實(shí)驗(yàn)分組及加藥：Manoalide通過購買獲得，開窗后將雞胚隨機(jī)分為兩組（Manoalide實(shí)驗(yàn)組和DMSO對(duì)照組）。每組8只雞胚。實(shí)驗(yàn)組加待測(cè)藥物Manoalide，對(duì)照組加相同劑量的對(duì)照液DMSO。將Manoalide或DMSO從開口處小心加到尿囊膜上，醫(yī)用膠布封口，放入37.8℃，50%～60%濕度的恒溫箱中孵育48小時(shí)。

4）結(jié)果觀察：加藥48小時(shí)后，將蛋殼從中線剪開，流凈蛋中內(nèi)容物，肉眼直接觀察開窗孔一側(cè)尿囊膜上血管的變化，記錄現(xiàn)象，并在體式顯微鏡下照相觀察，統(tǒng)計(jì)血管發(fā)育情況。

觀察指標(biāo)：以給藥點(diǎn)為中心，主干血管向中心盤的彎曲和靠近稱之為血管的吸引；周圍血管放射狀朝向中心的生長狀態(tài)，稱為血管輻輳。反之，無此向心生長情況，且比正常發(fā)育情況下的血管網(wǎng)密度小，血管細(xì)且數(shù)量顯著減少，出現(xiàn)明顯的無血管區(qū)域則存在待定的血管生長發(fā)育抑制作用。

結(jié)果如圖1所示，A為Manoalide處理的雞胚絨毛尿囊膜的血管變細(xì)，并且二級(jí)及三級(jí)血管分支變少。B為對(duì)血管密度增長率的統(tǒng)計(jì)，***P＜0.001?？梢?，Manoalide抑制了9天雞胚CAM的血管形成。

實(shí)施例2

雞胚卵黃囊膜（YSM）模型的建立及藥物處理

1）種蛋處理：將種蛋表面清潔，然后用1:1 000新潔爾滅液浸泡3min，拭干后將雞胚氣室向上，長軸與蛋托呈45°放入普通培養(yǎng)箱中孵化，設(shè)定溫度(37.8 ±0.5)℃和相對(duì)濕度60%，每天照蛋、轉(zhuǎn)蛋3次。

2）實(shí)驗(yàn)方法：取孵化2.5天的雞胚，將雞卵內(nèi)容物傾倒入無菌平皿中，將紅色和黑色記號(hào)筆標(biāo)記的兩個(gè)同樣大小的硅膠環(huán)放置到雞胚卵黃囊血管網(wǎng)上血管較少的不同位置，蓋好平皿蓋(不需封閉)，放入37～38℃孵育箱中繼續(xù)孵育3～4h。3～4h后，挑選硅膠環(huán)未見移位、卵黃囊膜完整、血管網(wǎng)及胚盤發(fā)育良好的雞胚，紅色標(biāo)記的硅膠環(huán)中加入待測(cè)藥物Manoalide，黑色標(biāo)記的膠圈加入相同劑量的對(duì)照液DMSO作為自身對(duì)照，然后繼續(xù)孵育。

結(jié)果觀察：于加藥后0h、12h、24h分別在體式顯微鏡下拍照，觀察膠圈內(nèi)和周圍的YSM血管密度、走向。采用Image-ProPlus6.0圖像分析系統(tǒng)分析拍攝實(shí)驗(yàn)區(qū)域整個(gè)硅膠圈內(nèi)的血管，以血管面積和血管密度的變化作為分析指標(biāo)。

加藥后12h的觀察結(jié)果如圖2所示，A左側(cè)為用0.1%DMSO處理的自身對(duì)照，右側(cè)為用Manoalide處理后的結(jié)果；B為對(duì)血管面積增長率的統(tǒng)計(jì)。*P＜0.05；**P＜0.01。可見，DPPA抑制了3天雞胚YSM的血管生成。

實(shí)施例3

雞胚絨毛尿囊膜（CAM）接種腫瘤細(xì)胞模型的建立及藥物處理：將購買的雞胚種蛋用75%乙醇擦拭表面，雞胚氣室向上，長軸與蛋托呈45°放入普通培養(yǎng)箱中孵化，設(shè)定溫度（38±0.5）℃和相對(duì)濕度60%，每天照蛋、轉(zhuǎn)蛋，棄去未受精或死胚。持續(xù)孵育8～10d，標(biāo)記氣室，確定開窗位置，用75%酒精消毒后，用牙科鉆在標(biāo)記處磨出“+”痕跡，再用眼科彎鑷小心揭去蛋殼，形成直徑約1cm的缺口，用酒精棉球擦拭缺口外緣，用眼科彎鑷輕輕揭掉蛋膜，暴露出含有豐富血管的雞胚卵黃膜組織，用滅菌醫(yī)用膠布呈十字交叉封口，適應(yīng)9～16 h。在超凈臺(tái)上揭開醫(yī)用膠布。將無菌膠圈放在卵黃膜一級(jí)血管的半側(cè)附近。把已消過毒的硅膠藥圈放在卵黃膜一級(jí)血管與二級(jí)血管的交匯處。取對(duì)數(shù)生長期的 MDA-MB-231 細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化、PBS洗滌、800rpm5min離心去上清后用1mL PBS基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按每個(gè)種蛋 CAM 的硅膠藥圈中加入 50 μL細(xì)胞懸液(約含3×10⁶～5 ×10⁶個(gè)細(xì)胞)，配置細(xì)胞懸液并加入蛋中，保證膠圈與CAM緊貼，以確保加入的細(xì)胞懸液不流出膠圈。

30 h后，在超凈臺(tái)上打開膠布，觀察腫瘤生長情況，淘汰 CAM膜上沒有腫瘤生長的雞胚種蛋。將帶有腫瘤的雞胚種蛋隨機(jī)分成 4 組，前3組為實(shí)驗(yàn)組，在膠圈中加2μM，4μM，6μM的50μL /個(gè)Manoalide，對(duì)照組給予相同劑量的 DMSO。用無菌膠布封口，孵育箱繼續(xù)孵育。24h加藥一次，連續(xù)加藥 3次，確保達(dá)到藥物的有效濃度。

第3次加藥后大約16 h，沿中線剪開雞蛋，倒凈里面的內(nèi)容物，PBS清洗，體視顯微鏡拍照測(cè)量腫瘤的體積，測(cè)量腫瘤區(qū)域血管的面積(V)，計(jì)算 MVD。腫瘤體積= 4π/3（長徑×短徑²）。MVD(%) = 腫瘤血管面積/(腫瘤區(qū)域亮區(qū)面積 + 腫瘤區(qū)域暗區(qū)面積) ×100%。將 CAM 移植瘤取出，置PBS中清洗。包埋、切片、H&E染色。

H&E染色：H&E染色是取雞胚絨毛尿囊膜上生長的腫瘤組織得到的石蠟切片，厚度為3～4μm。組織石蠟切片脫蠟、蘇木素染色4分鐘，反藍(lán)，伊紅染色3 秒，37℃過夜、封片。正置顯微鏡下觀察各個(gè)組織血管密度變化并拍照。