本發(fā)明涉及腫瘤的細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測嵌合抗原受體T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用的模型和方法。

背景技術(shù)：

肝癌是亞洲死亡率最高的癌癥之一。目前，肝癌有效的治療方法是部分肝臟切除、肝臟移植、化療、動(dòng)脈化療栓塞。盡管在肝癌診斷和治療上都有許多的新發(fā)現(xiàn)，然而，肝癌的五年生存率仍然只有10％。目前，許多新的潛在免疫治療手段都開展了臨床試驗(yàn)，如CAR T細(xì)胞免疫治療、免疫抑制檢查點(diǎn)抗體。鑒于低生存率，嚴(yán)謹(jǐn)而有效模擬人體的臨床前評(píng)估模型是目前肝癌治療研發(fā)平臺(tái)的緊急需求。

然而對(duì)于實(shí)體瘤而言，嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor，CAR)T細(xì)胞的臨床前試驗(yàn)結(jié)果與臨床試驗(yàn)結(jié)果存在著巨大的差異，導(dǎo)致目前通過臨床審批、成為上市藥物的實(shí)體瘤CAR T細(xì)胞治療寥寥可數(shù)。而CAR T細(xì)胞的臨床前和臨床治療結(jié)果差異巨大的原因還未知，但可能是多因素影響的。

通過對(duì)比血液腫瘤和實(shí)體瘤之間的差異，推測實(shí)體瘤體內(nèi)微環(huán)境中可能存在的CAR T細(xì)胞阻礙：1)突破實(shí)體瘤組織物理屏障，腫瘤組織存在妨礙CAR T細(xì)胞浸潤至腫瘤部位的物理屏障；2)腫瘤代謝微環(huán)境中相對(duì)酸性、缺乏氧和營養(yǎng)物質(zhì)，阻礙CAR T細(xì)胞生存、增殖和殺傷作用；3)腫瘤抑制性分泌因子和細(xì)胞因子的免疫抑制作用；4)免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Tregs)、髓系來源的抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)和嗜中性粒細(xì)胞(Neutrophils，TANs)。而以上列舉的條件是常規(guī)實(shí)體瘤細(xì)胞系構(gòu)建的異種移植小鼠模型無法重現(xiàn)的，導(dǎo)致實(shí)體瘤CAR T細(xì)胞療效的臨床前評(píng)估不準(zhǔn)確，臨床前和臨床治療結(jié)果差異懸殊。

現(xiàn)有技術(shù)中存在的都是將肝癌細(xì)胞系體外識(shí)別殺傷評(píng)估和肝癌細(xì)胞系體內(nèi)識(shí)別殺傷評(píng)估，而肝癌細(xì)胞系的體內(nèi)識(shí)別殺傷評(píng)估是現(xiàn)有的CAR T細(xì)胞臨床前療效評(píng)估方法。然而該方法無法有效模擬CAR T細(xì)胞對(duì)肝癌異質(zhì)性、腫瘤組織物理屏障和代謝屏障、免疫抑制微環(huán)境等效應(yīng)的療效。對(duì)于CAR T細(xì)胞，原代腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性將可能是CAR T細(xì)胞治療耐藥的重要原因之一，而腫瘤細(xì)胞系構(gòu)建的療效評(píng)估模型卻無法重現(xiàn)的腫瘤異質(zhì)性對(duì)CAR T細(xì)胞的耐藥作用。由此可見，實(shí)體瘤CAR T細(xì)胞的臨床前評(píng)估方法并未成熟，亟需發(fā)現(xiàn)新的方法。

此外，肝癌又是實(shí)體瘤中的一個(gè)特殊例子。因?yàn)槎闻K組織是一個(gè)特殊的器官，參與人體造血過程。肝臟亦被稱為免疫幸免器官，即肝臟移植發(fā)生移植物排斥宿主疾病的概率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它器官移植，但具體的作用機(jī)制并未見報(bào)道。但由此可推知，肝臟組織存在某種緩解免疫效應(yīng)的作用機(jī)制。

CN 102178568 A公開了一種用于研究肝細(xì)胞肝癌上皮間質(zhì)樣變動(dòng)態(tài)過程的動(dòng)物模型的方法，取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在超聲設(shè)備引導(dǎo)下肝臟原位接種腫瘤細(xì)胞，動(dòng)態(tài)觀察上皮間質(zhì)樣變相關(guān)指標(biāo)變化以及肺轉(zhuǎn)移情況。但其無法用來評(píng)估CAR T細(xì)胞在體內(nèi)的療效。CAR T細(xì)胞對(duì)人體肝癌的臨床治療則可能受到更強(qiáng)烈的免疫抑制作用，靶向肝癌的CAR T細(xì)胞對(duì)肝癌臨床前評(píng)估模型的要求更高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前靶向肝癌CAR T細(xì)胞臨床前評(píng)估手段無法有效模擬和評(píng)估肝癌CAR T細(xì)胞的體內(nèi)療效，本發(fā)明提供一種檢測嵌合抗原受體T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用的模型和方法，通過在高度免疫缺陷小鼠體內(nèi)移植肝癌病人來源的腫瘤組織塊，并將肝癌CAR T細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，構(gòu)建原代肝癌異種移植模型，并利用該模型評(píng)估靶向肝癌CAR T細(xì)胞的臨床前療效。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種檢測嵌合抗原受體T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用的模型，所述模型為通過將所述原代肝癌組織移植到模型生物體內(nèi)，再將嵌合抗原受體T細(xì)胞移植到模型生物體內(nèi)而獲得。

優(yōu)選地，所述原代肝癌組織移植的體積為1-5mm³，例如可以是1mm³、2mm³、3mm³、4mm³、5mm³，優(yōu)選為2-3mm³。

優(yōu)選地，所述原代肝癌組織移植的數(shù)量為1-5塊，例如可以是1塊、2塊、3塊、4塊、5塊，優(yōu)選為2-3塊。

優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體T細(xì)胞移植的數(shù)量為(1-4)×10^-6，例如可以是1×10^-6、2×10^-6、3×10^-6、4×10^-6，優(yōu)選為2×10^-6。

本發(fā)明中，所述模型用于非治療目的的檢測嵌合抗原受體T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用，通過將肝癌病人來源的腫瘤組織移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)，并將肝癌CAR T細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，構(gòu)建可有效模擬肝癌病人體內(nèi)病理微環(huán)境的人源化小鼠模型，并在該模型中模擬臨床治療模型多次移植CAR T細(xì)胞，確保CAR T細(xì)胞的穩(wěn)定供給，CAR T細(xì)胞激活將高表達(dá)PD-1、CTLA-4、TIM3等免疫抑制檢查點(diǎn)受體，擬靶向殺傷的肝癌細(xì)胞的免疫抑制檢查點(diǎn)配體的表達(dá)與否，及其輔助免疫抑制微環(huán)境形成的因素，將極大程度決定CAR T細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤殺傷能力，并通過腫瘤監(jiān)控評(píng)估CAR T細(xì)胞對(duì)肝癌的治療作用。

根據(jù)本發(fā)明，所述原代肝癌組織為邊緣淡黃色組織和/或中間白色組織，優(yōu)選為邊緣淡黃色組織，所述邊緣淡黃色組織能夠更好的與模型生物相容。

根據(jù)本發(fā)明，所述將所述原代肝癌組織移植到模型生物體內(nèi)的移植方式為皮下移植、腎囊膜下移植或肝臟原位移植中的一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為肝臟原位移植，所述肝臟原位移植通過肝臟微環(huán)境可有效促進(jìn)肝癌細(xì)胞及肝癌相關(guān)細(xì)胞如MDSC、Treg、TAM、TAN等的生存，則可有效模擬肝癌相關(guān)細(xì)胞對(duì)肝癌腫瘤起始、擴(kuò)增、遷移、耐藥等的作用，更真實(shí)地模擬嵌合抗原受體T細(xì)胞在人體肝癌微環(huán)境中的細(xì)胞效應(yīng)和抑制作用。

所述的皮下移植具體步驟如下：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成直徑為3mm的腫瘤組織小塊，每只受體小鼠移植2-3小塊，將肝癌腫瘤組織小塊用基質(zhì)凝膠(Matrix Gel)包裹備用，用剪刀在小鼠下腹部一側(cè)剪開小口，用鑷子將Matrix Gel包裹的腫瘤組織塊夾入小口中，用傷口夾將小口縫合；腫瘤監(jiān)控：通過游標(biāo)卡尺定時(shí)量取腫瘤體積監(jiān)控腫瘤生長和對(duì)藥物的反應(yīng)；或通過熒光素酶-活體成像技術(shù)檢測；或通過流式細(xì)胞技術(shù)和免疫組化技檢測。

所述的腎囊膜下移植具體步驟如下：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成體積為2mm³的腫瘤組織小塊備用，每只受體小鼠移植2-3小塊；將小鼠麻醉，選取小鼠一側(cè)腎臟，在腎包囊上開小口(開口大小與移植管口相當(dāng))，用青霉素-生理鹽水濕潤腎包囊，以移植管吸取帶一只的聚合卵巢并移植茹受體小鼠腎囊膜下(遠(yuǎn)離手術(shù)開口)，將腎臟放回體腔中，并向體腔中注入適量青霉素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，于傷口涂抹碘酒消毒；腫瘤監(jiān)控：通過熒光素酶-活體成像技術(shù)檢測，或通過流式細(xì)胞技術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測。

所述的肝臟原位移植具體步驟如下：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成體積為2mm3的腫瘤組織小塊備用，每只受體小鼠移植2-3小塊；麻醉小鼠，沿腹中線剪開小鼠皮膚和腹膜，暴露肝葉，擠出肝臟左外葉，用眼科沙眼鏟在肝左外葉中部戳一個(gè)3-5mm長孔，棉簽局部止血后，用鑷子將腫瘤組織塊夾入小孔內(nèi)，用激光筆閉合傷口并止血，用青霉素-生理鹽水涂抹傷口，縫合腹膜和皮膚，用碘酒消毒傷口；腫瘤監(jiān)控：通過熒光素酶-活體成像技術(shù)檢測，或通過流式細(xì)胞技術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測。

優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體T細(xì)胞在所述原代肝癌組織移植到模型生物體內(nèi)的5-10天后進(jìn)行移植，例如可以是5天、6天、7天、8天、9天或10天，優(yōu)選為6-8天進(jìn)行移植，進(jìn)一步優(yōu)選為7天。

優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體T細(xì)胞進(jìn)行多次移植，優(yōu)選為進(jìn)行2-4次移植，例如可以是2次、3次或4次，進(jìn)一步優(yōu)選為進(jìn)行2次移植。

優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體T細(xì)胞進(jìn)行多次移植，其中相鄰兩次移植的間隔時(shí)間為5-10天，例如可以是5天、6天、7天、8天、9天或10天，優(yōu)選為6-8天，進(jìn)一步優(yōu)選為7天。

根據(jù)本發(fā)明，所述模型生物體為本領(lǐng)域常規(guī)的模型生物，本發(fā)明中選用兔、鼠、貓、狗或猴中的任意一種或至少兩種組合的模型，優(yōu)選為免疫缺陷型小鼠模型，進(jìn)一步優(yōu)選為NOD/SCID、Rag2-/-IL2rg-/-、Rag1/-IL2rg-/-、NOD/SCID IL2rg-/-小鼠模型，最優(yōu)選為NOD/SCID IL2rg-/-小鼠模型。

根據(jù)本發(fā)明，所述嵌合抗原受體T細(xì)胞為特異性識(shí)別肝癌細(xì)胞的嵌合抗原受體T細(xì)胞。

所述嵌合抗原受體主要包括信號(hào)肽、抗原識(shí)別區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)串聯(lián)構(gòu)成，其中，所述胞內(nèi)區(qū)主要包括人4-1BB胞內(nèi)區(qū)。

本發(fā)明中，通過在GPC3 CAR分子中引入人4-1BB胞內(nèi)信號(hào)域，構(gòu)建成的GPC3 CAR T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其分泌偏向于Th1類型，對(duì)肝癌細(xì)胞具有強(qiáng)烈的細(xì)胞殺傷效應(yīng)，且高表達(dá)Th1細(xì)胞因子，極大程度刺激非CAR T細(xì)胞引起的腫瘤殺傷效應(yīng)，可有效防止GPC3-肝癌細(xì)胞的逃逸和潛在復(fù)發(fā)威脅。

根據(jù)本發(fā)明，過表達(dá)特異性靶向GPC3的嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor，CAR)T細(xì)胞，可特異性識(shí)別GPC3⁺腫瘤抗原，殺傷腫瘤細(xì)胞，具有顯著的體內(nèi)外擴(kuò)增和腫瘤殺傷作用，所述抗原識(shí)別區(qū)為抗GPC3抗體、CD133、MUC1(Mucin 1,cell surface associated)或CEA(Carcinoembryonic Antigen)中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為抗GPC3抗體。

根據(jù)本發(fā)明，所述信號(hào)肽為能夠指導(dǎo)嵌合抗原受體跨膜轉(zhuǎn)移的信號(hào)肽都是可行的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇本領(lǐng)域常規(guī)的信號(hào)肽，所述信號(hào)肽為人IgM信號(hào)肽和/或人CD8α信號(hào)肽，優(yōu)選為人IgM信號(hào)肽；

優(yōu)選地，所述的跨膜區(qū)為人CD28跨膜區(qū)和/或人CD8跨膜區(qū)，優(yōu)選為人CD28跨膜區(qū)。

根據(jù)本發(fā)明，所述胞內(nèi)區(qū)除了含有人4-1BB胞內(nèi)區(qū)以外，還包括人CD28胞內(nèi)區(qū)、人CD3ζ胞內(nèi)區(qū)或人4-1BB胞內(nèi)區(qū)中的任意一種或至少兩種的組合，所述組合例如可以是人CD28胞內(nèi)區(qū)、人CD3ζ胞內(nèi)區(qū)，人CD28胞內(nèi)區(qū)、人4-1BB胞內(nèi)區(qū)，人CD3ζ胞內(nèi)區(qū)、人4-1BB胞內(nèi)區(qū)或人CD28胞內(nèi)區(qū)、人CD3ζ胞內(nèi)區(qū)和人4-1BB胞內(nèi)區(qū)，優(yōu)選為人CD28胞內(nèi)區(qū)和人CD3ζ胞內(nèi)區(qū)的組合，在本發(fā)明中，所述完整的胞內(nèi)區(qū)為人CD28胞內(nèi)區(qū)、人4-1BB胞內(nèi)區(qū)和人CD3ζ胞內(nèi)區(qū)串聯(lián)構(gòu)成。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述嵌合抗原受體由人IgM信號(hào)肽、抗GPC3抗體、人CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、人4-1BB胞內(nèi)區(qū)和人CD3ζ胞內(nèi)區(qū)串聯(lián)構(gòu)成，即IgM-GPC3-CD28-4-1BB-CD3ξ(CAR GPC3)。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，所述嵌合抗原受體由人IgM信號(hào)肽、抗GPC3抗體、人CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、人4-1BB胞內(nèi)區(qū)和人CD3ζ胞內(nèi)區(qū)串聯(lián)構(gòu)成，其對(duì)腫瘤的識(shí)別殺傷效果最好，可靶向GPC3-腫瘤細(xì)胞，有效抑制肝癌生長。

優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列為SEQ ID NO.1，核酸序列為SEQ ID NO.2。

所述嵌合抗原受體基因合成序列IgM-GPC3-CD28-4-1BB-CD3ξ的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR.

所述嵌合抗原受體基因合成序列IgM-GPC3-CD28-4-1BB-CD3ξ的核酸序列(SEQ ID NO.2)如下：

5-atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaaatacacatgttcctcctacgttcggatcggggaccaagctggaaataaaaggtggaggcggttcaggcggaggtggcagcggcggtggcgggtcgcaggttcaactgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttcgggctacacatttactgactatgaaatgcactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctaaaatggattggagctcttgatcctaaaactggtgatactgcctacagtcagaagttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtacaagattctactcctatacttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc-3.

本發(fā)明中，是通過將所述原代肝癌組織的邊緣淡黃色組織移植到模型生物體內(nèi)，再通過多次將SEQ ID NO.2所示的核酸序列轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞移植到模型生物體內(nèi)而獲得，通過檢測模型生物體內(nèi)皮下肝癌腫瘤組織塊來判斷嵌合抗原受體T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用。

優(yōu)選地，所述檢測的方式為量取肝癌腫瘤組織塊大小、稱量肝癌腫瘤組織塊重量、熒光素酶-活體成像技術(shù)或流式細(xì)胞儀和免疫組化技術(shù)中的任意一種或至少兩種的組合，

根據(jù)本發(fā)明，所述量取肝癌腫瘤組織塊大小、稱量肝癌腫瘤組織塊重量的方式為本領(lǐng)域常規(guī)的量取方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行選擇，在此不做特殊限定，本發(fā)明采用游標(biāo)卡尺進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明，熒光素酶-活體成像技術(shù)的方式為本領(lǐng)域常規(guī)的量取方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行選擇，在此不做特殊限定。

根據(jù)本發(fā)明，流式細(xì)胞儀和免疫組化技術(shù)具體為：原代肝癌組織移植后60天，CO₂處死小鼠，取小鼠外周血、肝臟、脾臟、肺、腎臟，通過流式細(xì)胞技術(shù)和免疫組化技術(shù)，檢測肝癌細(xì)胞的比例和分布。

優(yōu)選地，所述腫瘤組織塊的檢測時(shí)間為多次移植完嵌合抗原受體T細(xì)胞后進(jìn)行，每2-5天，例如可以是2天、3天、4天或5天，優(yōu)選3天量取一次。

第二方面，本發(fā)明提供一種檢測嵌合抗原受體T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用的方法，包括如下步驟：通過檢測權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的模型生物體內(nèi)皮下肝癌腫瘤組織塊來判斷嵌合抗原受體T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用。

優(yōu)選地，所述檢測的方式為量取肝癌腫瘤組織塊大小、稱量肝癌腫瘤組織塊重量、熒光素酶-活體成像技術(shù)或流式細(xì)胞儀和免疫組化技術(shù)中的任意一種或至少兩種的組合，

根據(jù)本發(fā)明，所述量取肝癌腫瘤組織塊大小、稱量肝癌腫瘤組織塊重量、的方式為本領(lǐng)域常規(guī)的量取方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行選擇，在此不做特殊限定，本發(fā)明采用游標(biāo)卡尺、

根據(jù)本發(fā)明，熒光素酶-活體成像技術(shù)的方式為本領(lǐng)域常規(guī)的量取方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行選擇，在此不做特殊限定。

根據(jù)本發(fā)明，流式細(xì)胞儀和免疫組化技術(shù)具體為：原代肝癌組織移植后60天，CO₂處死小鼠，取小鼠外周血、肝臟、脾臟、肺、腎臟，通過流式細(xì)胞技術(shù)和免疫組化技術(shù)，檢測肝癌細(xì)胞的比例和分布。

優(yōu)選地，所述腫瘤組織塊的檢測時(shí)間為多次移植完嵌合抗原受體T細(xì)胞后進(jìn)行，每2-5天，例如可以是2天、3天、4天或5天，優(yōu)選3天量取一次。

第三方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的模型或如第二方面所述的方法在評(píng)估CAR T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞抑制效果中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明的模型可有效模擬病人的腫瘤惡性程度，評(píng)估CAR T細(xì)胞對(duì)不同惡性程度的肝癌的抑制作用；本發(fā)明模型可有效評(píng)估原代肝癌細(xì)胞中的免疫抑制檢查點(diǎn)分子的表達(dá)對(duì)CAR T細(xì)胞的抑制作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明嵌合抗原受體T細(xì)胞的感染比例；

圖2為本發(fā)明激活后的嵌合抗原受體T細(xì)胞的免疫抑制檢查點(diǎn)分子表達(dá)；

圖3本發(fā)明通過免疫組化對(duì)比肝癌病人原代腫瘤組織和PDX模型腫瘤組織中GPC3和AFP的表達(dá)情況；

圖4為本發(fā)明CAR-GPC3 T細(xì)胞體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞生長；

圖5為本發(fā)明CAR-GPC3 T細(xì)胞抑制1號(hào)肝癌病人PDX1模型中腫瘤生長；

圖6為本發(fā)明CAR-GPC3 T細(xì)胞抑制2號(hào)肝癌病人PDX2模型中腫瘤生長；

圖7為本發(fā)明CAR-GPC3 T細(xì)胞抑制3號(hào)肝癌病人PDX3模型中腫瘤生長。

具體實(shí)施方式

為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實(shí)施例范圍內(nèi)。

實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：嵌合抗原受體T細(xì)胞的構(gòu)建

(1)通過全基因合成人IgM信號(hào)肽、抗GPC3抗體、人CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、人4-1BB胞內(nèi)區(qū)和人CD3ζ胞內(nèi)區(qū)，即CAR-GPC3-CD28-4-1BB-CD3ξ(CAR-GPC3)，其序列如SEQ ID NO.4所示，再全基因合成CAR-CD19-CD28-4-1BB-CD3ξ(CAR CD19)核酸序列作為陰性對(duì)照，合成的基因C端含限制性內(nèi)切酶Pme1酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基和N端含限制性內(nèi)切酶Spe1酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基；

(2)通過酶切連接將合成基因連接入pWPXLd-EGFP慢病毒載體，分別獲得CAR質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體pWPXLd-CAR-GPC3-2A-EGFP和pWPXLd-CAR-CD19-2A-EGFP；

(3)慢病毒包裝：pWPXLd-CAR-GPC3-2A-EGFP、pWPXLd-CAR-CD19-2A-EGFP分別與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2共同轉(zhuǎn)導(dǎo)入293T細(xì)胞(處于生長高峰期，150mm培養(yǎng)皿豐度為80-90％)，加入試劑及劑量如下：

(4)分別于轉(zhuǎn)化后24、48和72小時(shí)，收集培養(yǎng)基上清，并加入新鮮培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基+1％FBS+1％雙抗，病毒溶解后，收集病毒溶液分裝于PCR管，凍存于-80℃待用；

(5)人體T細(xì)胞的分離純化：通過Ficoll密度梯度法分離出人體血液中的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解去除紅細(xì)胞后，再通過MACS Pan-T磁珠分選出T細(xì)胞；

(6)通過包被CD2、CD3、CD28抗體的磁珠刺激分選后的T細(xì)胞；

(7)在刺激后的T細(xì)胞中，分別加入表達(dá)CAR-GPC3、CAR-CD19慢病毒、8μg/mL的polybrene和300IU/mL IL-2；

(8)置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，300g離心5min，去上清，用含300IU/mL IL-2的新鮮培養(yǎng)基重懸，即得CAR-GPC3 T細(xì)胞和CAR–CD19T細(xì)胞；

(9)通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測CAR-GPC3、CAR-CD19 T細(xì)胞的慢病毒感染效率(GFP陽性細(xì)胞比例)，結(jié)果如圖1所示；

(10)通過流式細(xì)胞技術(shù)CAR-GPC3 T細(xì)胞(以新鮮人體T細(xì)胞為陰性對(duì)照)中免疫抑制檢查點(diǎn)分子PD-1、CTLA-4、TIM3的表達(dá)水平，結(jié)果如圖2所示。

從圖1和圖2的結(jié)果可以看出，CAR GPC3和CAR CD19病毒感染人體T細(xì)胞分別約達(dá)到60％、50％；而腫瘤GPC3抗原激活后的CAR GPC3 T細(xì)胞高表達(dá)免疫抑制檢查點(diǎn)分子PD-1、CTLA4、TIM3，顯示CAR GPC3 T細(xì)胞的免疫殺傷作用會(huì)受到腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)免疫抑制檢查點(diǎn)分子配體的細(xì)胞抑制，表明可重建腫瘤相關(guān)細(xì)胞及其免疫抑制作用對(duì)嵌合抗原受體T細(xì)胞臨床前評(píng)估的必要性。

實(shí)施例2：通過皮下移植肝癌PDX模型的構(gòu)建

(1)原代肝癌樣本處理：原代肝癌腫瘤組織樣本來源于三甲醫(yī)院的腫瘤組織樣本庫，肝癌樣本需浸泡于RPMI 1640培養(yǎng)基并保存于冰上運(yùn)輸。獲取腫瘤樣本后，選擇邊緣淡黃色/肉色部分腫瘤組織肝癌樣本，使用PBS(1％P/S)清洗2-3次，將樣本分成三份，一份凍存保種；一份進(jìn)行腫瘤組織切片和免疫組化分析；一份用于腫瘤移植備用；

(2)肝癌組織移植與監(jiān)控：采用皮下移植的方式，具體包括：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成直徑為3mm的腫瘤組織小塊,每只受體小鼠移植2-3小塊，將肝癌腫瘤組織小塊用Matrix Gel包裹備用，用剪刀在小鼠下腹部一側(cè)剪開小口，用鑷子將Matrix Gel包裹的腫瘤組織塊夾入小口中，用傷口夾將小口縫合；

(3)肝癌PDX小鼠模型傳代：將肝癌PDX小鼠通過CO₂處死小鼠，取小鼠腫瘤組織，剪取腫瘤組織外層淡黃色細(xì)胞，使用PBS(1％P/S)清洗2-3次，將樣本分成三份，一份凍存保種；一份進(jìn)行腫瘤組織切片和免疫組化分析；一份用于腫瘤移植；

(4)經(jīng)過3次傳代移植后，獲取PDX模型腫瘤組織進(jìn)行組織切片和(GPC3、AFP)免疫組化染色(以相對(duì)應(yīng)的病人原代肝癌組織為對(duì)照)，對(duì)比PDX模型對(duì)病人腫瘤樣本組織結(jié)構(gòu)、腫瘤標(biāo)志物表達(dá)情況的模擬。

(5)腫瘤監(jiān)控：于腫瘤移植后60天，CO₂處死小鼠，取小鼠外周血、肝臟、脾臟、肺、腎臟，通過流式細(xì)胞技術(shù)和免疫組化技術(shù)，檢測肝癌病人原代腫瘤組織和PDX模型腫瘤組織中GPC3和AFP的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，多次傳代后的PDX模型仍可有效保留和模擬原代肝癌腫瘤組織結(jié)構(gòu)特征和腫瘤標(biāo)志物(GPC3和AFP)的表達(dá)，是抗原特異性靶向的嵌合抗原受體T細(xì)胞的療效評(píng)估的必要前提條件。

實(shí)施例3：通過肝臟原位移植肝癌PDX模型的構(gòu)建

(1)原代肝癌樣本處理：原代肝癌腫瘤組織樣本來源于三甲醫(yī)院的腫瘤組織樣本庫，肝癌樣本需浸泡于RPMI 1640培養(yǎng)基并保存于冰上運(yùn)輸。獲取腫瘤樣本后，選擇邊緣淡黃色/肉色部分腫瘤組織肝癌樣本，使用PBS(1％P/S)清洗2-3次，將樣本分成三份，一份凍存保種；一份進(jìn)行腫瘤組織切片和免疫組化分析；一份用于腫瘤移植備用；

(2)肝癌組織移植與監(jiān)控：采用肝臟原位移植的方式，具體包括：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成體積為2mm³的腫瘤組織小塊備用,每只受體小鼠移植2-3小塊；麻醉小鼠，沿腹中線剪開小鼠皮膚和腹膜，暴露肝葉，擠出肝臟左外葉，用眼科沙眼鏟在肝左外葉中部戳一個(gè)3-5mm長孔，棉簽局部止血后，用鑷子將腫瘤組織塊夾入小孔內(nèi)，用激光筆閉合傷口并止血，用青霉素-生理鹽水涂抹傷口，縫合腹膜和皮膚，用碘酒消毒傷口；

(3)肝癌PDX小鼠模型傳代：將肝癌PDX小鼠通過CO₂處死小鼠，取小鼠腫瘤組織，剪取腫瘤組織外層淡黃色細(xì)胞，使用PBS(1％P/S)清洗2-3次，將樣本分成三份，一份凍存保種；一份進(jìn)行腫瘤組織切片和免疫組化分析；一份用于腫瘤移植；

(4)經(jīng)過3次傳代移植后，獲取PDX模型腫瘤組織進(jìn)行組織切片和(GPC3、AFP)免疫組化染色(以相對(duì)應(yīng)的病人原代肝癌組織為對(duì)照)，對(duì)比PDX模型對(duì)病人腫瘤樣本組織結(jié)構(gòu)、腫瘤標(biāo)志物表達(dá)情況的模擬。

(5)腫瘤監(jiān)控：于腫瘤移植后60天，CO₂處死小鼠，取小鼠外周血、肝臟、脾臟、肺、腎臟，通過流式細(xì)胞技術(shù)和免疫組化技術(shù)，檢測肝癌病人原代腫瘤組織和PDX模型腫瘤組織中GPC3和AFP的表達(dá)情況。

其結(jié)果與實(shí)施例2結(jié)果類似，多次傳代后的PDX模型仍可有效保留和模擬原代肝癌腫瘤組織結(jié)構(gòu)特征和腫瘤標(biāo)志物(GPC3和AFP)的表達(dá)。

實(shí)施例4：對(duì)比肝癌細(xì)胞系和原代肝癌組織異種移植模型評(píng)估CAR T細(xì)胞的區(qū)別

(1)將細(xì)胞數(shù)為1×10⁶的HepG2-GL細(xì)胞系(GPC3+肝癌細(xì)胞系，GL為熒光素酶標(biāo)記)皮下移植入NOD/SCID IL2rg-/-免疫缺陷小鼠體內(nèi)，構(gòu)建肝癌異種移植小鼠模型；

(2)通過游標(biāo)卡尺每日量取皮下肝癌腫瘤組織塊的大小，當(dāng)腫瘤組織達(dá)到50-100mm3(腫瘤移植后7天)，則通過尾靜脈注射將2×10⁶的CAR-GPC3 T、CAR-CD19 T細(xì)胞分別移植入肝癌小鼠體內(nèi)；首次CAR T注射后7天(腫瘤移植后14天)再進(jìn)行第二次同劑量注射；

(3)CAR T細(xì)胞移植后，每周兩次通過游標(biāo)卡尺量取兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠皮下腫瘤組織塊大小(即腫瘤移植后第7、10、13、16、19、21、24、27、30天)，并記錄，繪制腫瘤生長曲線圖，結(jié)果如圖4所示；

從圖4可以看出，肝癌細(xì)胞系在免疫缺陷小鼠體內(nèi)的生長速度非?？?，于第7天即達(dá)可檢測到50-100mm³腫瘤塊，而通過肝癌細(xì)胞系小鼠模型評(píng)估CAR T細(xì)胞的體內(nèi)療效可初步反映CAR T細(xì)胞具有一定的腫瘤抑制作用。

實(shí)施例5：對(duì)比PD-L1+/-原代肝癌組織異種移植模型評(píng)估CAR T細(xì)胞的區(qū)別

(1)通過實(shí)施例2-3的PDX模型構(gòu)建的方法，分別構(gòu)建了1、2、3號(hào)肝癌病人來源的異種移植模型；其中，#1和#2病人為PD-L1陰性，#3病人為PD-L1陽性；肝癌惡性程度：#3>#2>#1；

(2)移植了原代肝癌組織后，通過游標(biāo)卡尺每日量取皮下肝癌腫瘤組織塊的大小，當(dāng)腫瘤組織達(dá)到50-100mm3，則通過尾靜脈注射將2×10⁶的CAR-GPC3 T、CAR-CD19 T細(xì)胞(對(duì)照組)分別移植入肝癌小鼠體內(nèi)；首次CAR T注射后7天(腫瘤移植后14天)再進(jìn)行第二次同劑量注射；

(3)注射了CAR T細(xì)胞后，每三天通過游標(biāo)卡尺量取并記錄皮下肝癌腫瘤組織塊的大小，作CAR T細(xì)胞對(duì)腫瘤生長的抑制作用圖，結(jié)果如圖5-7所示。

由圖5-7可知，PDX模型的增長速度PDX#3>PDX#2>PDX#1與病人的腫瘤惡性程度有關(guān)，即肝癌PDX模型可有效模擬病人的腫瘤惡性程度，并能評(píng)估CAR T細(xì)胞對(duì)不同惡性程度的肝癌的抑制作用；CAR GPC3 T細(xì)胞治療在PD-L1陽性的肝癌PDX模型中會(huì)受到抑制，即肝癌PDX模型可有效評(píng)估原代肝癌細(xì)胞中的免疫抑制檢查點(diǎn)分子的表達(dá)對(duì)CAR T細(xì)胞的抑制作用。

綜上所述，本發(fā)明的模型可有效模擬病人的腫瘤惡性程度，評(píng)估CAR T細(xì)胞對(duì)不同惡性程度的肝癌的抑制作用；本發(fā)明模型可有效評(píng)估原代肝癌細(xì)胞中的免疫抑制檢查點(diǎn)分子的表達(dá)對(duì)CAR T細(xì)胞的抑制作用。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院

<120> 一種檢測嵌合抗原受體T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用的模型和方法

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 528

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser

20 25 30

Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

35 40 45

Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu

50 55 60

Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

85 90 95

Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly

115 120 125

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

145 150 155 160

Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

165 170 175

Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His

180 185 190

Gly Leu Lys Trp Ile Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala

195 200 205

Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser

210 215 220

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr

260 265 270

Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His

275 280 285

Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser

290 295 300

Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

305 310 315 320

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys

325 330 335

Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

340 345 350

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

355 360 365

Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

370 375 380

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

385 390 395 400

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

405 410 415

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

420 425 430

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

435 440 445

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

450 455 460

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

465 470 475 480

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

485 490 495

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

500 505 510

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

515 520 525

<210> 2

<211> 1584

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 2

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagatg ttgtgatgac ccaaactcca ctctccctgc ctgtcagtct tggagatcaa 120

gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc cttgtacaca gtaatggaaa cacctattta 180

cattggtacc tgcagaagcc aggccagtct ccaaagctcc tgatctacaa agtttccaac 240

cgattttctg gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300

aagatcagca gagtggaggc tgaggatctg ggagtttatt tctgctctca aaatacacat 360

gttcctccta cgttcggatc ggggaccaag ctggaaataa aaggtggagg cggttcaggc 420

ggaggtggca gcggcggtgg cgggtcgcag gttcaactgc agcagtctgg ggctgagctg 480

gtgaggcctg gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt cgggctacac atttactgac 540

tatgaaatgc actgggtgaa gcagacacct gtgcatggcc taaaatggat tggagctctt 600

gatcctaaaa ctggtgatac tgcctacagt cagaagttca agggcaaggc cacactgact 660

gcagacaaat cctccagcac agcctacatg gagctccgca gcctgacatc tgaggactct 720

gccgtctatt actgtacaag attctactcc tatacttact ggggccaagg gactctggtc 780

actgtctctg cagcggccgc aattgaagtt atgtatcctc ctccttacct agacaatgag 840

aagagcaatg gaaccattat ccatgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt 900

cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg ggggagtcct ggcttgctat 960

agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc 1020

ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac 1080

cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaaacgggg cagaaagaaa 1140

ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1200

ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 1260

agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1320

aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1380

atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1440

gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1500

gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1560

cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1584