本發(fā)明屬于生物醫(yī)學工程材料技術領域，特別是軟骨損傷修復材料制備技術領域，具體涉及一種軟骨修復水凝膠及其制備方法。

背景技術：

關節(jié)軟骨自我修復能力差，臨床上對于關節(jié)炎和創(chuàng)傷導致的關節(jié)軟骨損傷尚無有效修復手段。隨著生物學和材料學的發(fā)展，軟骨組織工程為軟骨修復提供了新思路。

組織工程化軟骨用于關節(jié)軟骨損傷和缺損修復是目前組織工程中的研究熱點。組織工程化軟骨修復缺損軟骨的基本原理是將自體或異體組織細胞在體外進行培養(yǎng)擴增后，接種到良好生物性能的支架材料上，形成細胞-支架復合體，將復合體移植至軟骨缺損部位，隨著支架材料的慢慢降解，組織細胞形成具有與類似軟骨 功能的組織，以此達到修復缺損軟骨的目的。

作為軟骨組織工程的重要要素之一軟骨支架材料的制備，目前存在以下問題：（1）怎么樣提高支架材料的組織相容性；（2）怎樣制備出一種利于細胞植入、附著、吸收、排泄等生存三維立體結構的軟骨支架材料；（3）怎樣提高組織材料支架的機械力學性能及表面活性；（4）材料支架的降解轉歸及對人體影響如何，怎樣把控支架材料的降解率。所以對組織工程軟骨支架的選擇與制備應充分考慮到制備材料、支架類型以及制備方法的優(yōu)缺點。

正常關節(jié)結構的構成，包括軟骨區(qū)、軟骨鈣化區(qū)和骨化區(qū)等多個部分，這幾個部分的結構構成是不同的，但是逐漸過渡的，它們之間沒有明顯的界面，因而理化性質比較穩(wěn)定。然而目前組織工程軟骨支架材料的制備，與人體自然軟骨達不到正常過渡，容易導致組織相容性差、不易長合、應力集中、易磨損破碎等一系列問題。

軟骨基質的化學成分主要為嗜堿性軟骨粘蛋白，它以長鏈的透明質酸分子為主干，干鏈上以許多較短的蛋白質鏈連接硫酸軟骨素A、C和硫酸角質素。這種羽狀分支的大分子結合著大量的水，大分子又相互結合，并和膠原原纖維結合在一起形成凝膠結構。因此，水凝膠型的修復支架十分適合用于受損軟骨組織的修復。但是常規(guī)方法制備的水凝膠其孔隙率，結構尺寸和微孔結構的連通性均只能控制在一定范圍而不能精確在某一特定數(shù)值，其外形尺寸較單一，不能按照受損部位的情況去制作，而且常規(guī)方法所制得的水凝膠其力學強度較低。

三維打印技術（3D-printing）在生物組織工程中的研究國內外已有大量的研究報道，其中生物三維打印已在個性化醫(yī)療模型、仿生支架、藥物緩釋模式等方面應用，這為軟骨修復材料的發(fā)展帶來了新方向。生物三維打印其所打印的材料主要是以細胞、生物材料或是生長因子，利用計算機輔助軟件建模后，控制打印機沉積生物材料的速度和位置，來實現(xiàn)仿生活性支架或是仿生材料的制造。在組織工程的應用上，生物三維打印能一步到位地根據(jù)實際所需精準地構建修復材料的內外結構，所構建的組織修復材料與正常人體組織高度相似。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有的軟骨修復材料的制備精度不高，材料制備需時長，缺乏足夠的力學強度、誘導修復能力和血管化能力等缺陷，提供一種具有誘導修復作用的軟骨修復水凝膠及其制備方法。本發(fā)明以硫酸軟骨素為原料通過甲基丙烯酸化改性制備出甲基丙烯酸化硫酸軟骨素，再將其與聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物復合，制備出適合用于生物3D打印的打印材料，再通過生物3D打印技術制備出一種具有誘導修復作用的軟骨修復水凝膠。該軟骨修復水凝膠的免疫原性低，不會引起免疫排斥，材料來源豐富，具有良好的生物相容性和與正常軟骨相當?shù)牧W性能，且具有誘導損傷部位修復和血管化的能力。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為：一種軟骨修復水凝膠由甲基丙烯酸化硫酸軟骨素和聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物組成；按重量份數(shù)計：由甲基丙烯酸化硫酸軟骨素1份、聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物1~4份組成。

進一步的，所述的軟骨修復水凝膠為多層圓柱狀結構。

更進一步的，所述的聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物的分子量為8500g/mol，購自Sigma試劑公司。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的另一技術方案為：一種軟骨修復水凝膠的制備方法，所述的制備步驟具體如下：

（1）硫酸軟骨素的甲基丙烯酸化改性：將四丁基溴化銨溶于去離子水中，配制成0.75mol/L的溶液，倒入裝有離子交換樹脂的層析柱中，用去離子水洗滌離子交換樹脂至pH為中性；將硫酸軟骨素溶于去離子水中，配制成1g/L的硫酸軟骨素溶液，將硫酸軟骨素溶液加入到上述層析柱中，然后收集層析柱流出的液體，置于-80℃冷凍干燥機中冷凍干燥，得硫酸軟骨素-四丁基銨化合物（CS-TBA）；將得到的硫酸軟骨素-四丁基銨化合物（CS-TBA）溶解于二甲亞砜中，配制成30g/L的溶液，按硫酸軟骨素-四丁基銨化合物（CS-TBA）、4-二甲氨基吡啶與縮水甘油基甲基丙烯酸酯的質量比為1：1：0.1，加入4-二甲氨基吡啶和縮水甘油基甲基丙烯酸酯，在50~60℃的條件下反應48h，旋轉蒸發(fā)去除剩余的溶劑，得到甲基丙烯酸化硫酸軟骨素；

（2）仿生打印材料的復合：將步驟（1）制備的甲基丙烯酸化硫酸軟骨素與聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物，按質量比為1:1~4溶于PBS磷酸鹽緩沖溶液中，在4℃下攪拌12 h，配制成質量濃度為10%的仿生打印材料溶液，備用；

（3）仿生水凝膠的打?。簩⒉襟E（2）配制的仿生打印材料溶液裝入37℃預熱的微量輸出泵，打印噴頭37℃預熱，接收平臺37℃預熱；設置每層的紫外照射時間為9s，開始打印，打印完成后，用去離子水沖洗，得到軟骨修復水凝膠。

進一步的，所述的離子交換樹脂為50WX8型離子交換樹脂，購自Sigma試劑公司；所述的四丁基溴化銨、4-二甲氨基吡啶和縮水甘油基甲基丙烯酸酯購自麥克林試劑公司。

更進一步的，所述步驟（3）仿生水凝膠的打印在RegenHU 3D 打印機上進行，所述的RegenHU 3D 打印機為光固化型3D打印機，打印噴頭孔徑為0.3 mm。

更進一步的，所述步驟（3）仿生水凝膠的打印模型通過輔助軟件CAD或solidWord建模。

本發(fā)明的有益效果為：

（1）本發(fā)明公開的軟骨修復水凝膠具有誘導修復作用、免疫原性低，原材料豐富，制備方法簡單的優(yōu)點。

（2）本發(fā)明以甲基丙烯酸化硫酸軟骨素、聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物為基質，制備出3D仿生打印材料，然后利用三維打印技術進行仿生打印，不僅克服了硫酸軟骨素因為其流動性能差而不能用作3D打印的問題，同時通過三維打印技術所制得的具有誘導修復作用的軟骨修復水凝膠，具有與正常軟骨組織相當?shù)牧W性能，且可以根據(jù)患者受損部位實際情況建模，能真正達到個性化治療。

（3）本發(fā)明制備的軟骨修復水凝膠，是采用生物三維打印技術進行仿生打印；相比于傳統(tǒng)的組織工程軟骨材料制備方法，本發(fā)明所公開的制備方法具有支架微結構精確成型，有利于生長因子或細胞的黏附。

附圖說明

圖1為實施例與對比例的蛋白吸附能力評價結果圖；

圖2為實施例和對比例與成骨細胞MG63共培養(yǎng)3天和7天后細胞相對增殖率圖；

圖3為實施例和對比例的堿性磷酸酶試驗結果圖；

圖4為實施例和對比例的骨鈣蛋白酶聯(lián)吸附試驗結果圖。

具體實施例

下面結合實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步的說明。

實施例1

一種軟骨修復水凝膠由甲基丙烯酸化硫酸軟骨素和聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物組成；按重量份數(shù)計：由1份甲基丙烯酸化硫酸軟骨素和1份聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物組成。所述的軟骨修復水凝膠為多層圓柱狀結構，所述的聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物的分子量為8500g/mol，購自Sigma試劑公司。

實施例2

一種軟骨修復水凝膠由甲基丙烯酸化硫酸軟骨素和聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物組成；按重量份數(shù)計：由1份甲基丙烯酸化硫酸軟骨素和2份聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物組成。所述的軟骨修復水凝膠為多層圓柱狀結構，所述的聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物的分子量為8500g/mol，購自Sigma試劑公司。

實施例3

一種軟骨修復水凝膠由甲基丙烯酸化硫酸軟骨素和聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物組成；按重量份數(shù)計：由1份甲基丙烯酸化硫酸軟骨素和4份聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物組成。所述的軟骨修復水凝膠為多層圓柱狀結構，所述的聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物的分子量為8500g/mol，購自Sigma試劑公司。

實施例4

實施例1～實施例3任一例一種軟骨修復水凝膠，其制備方法的具體步驟如下：

（1）硫酸軟骨素的甲基丙烯酸化改性：將四丁基溴化銨溶于去離子水中，配制成0.75mol/L的溶液，倒入裝有離子交換樹脂的層析柱中，用去離子水洗滌離子交換樹脂至pH為中性；將硫酸軟骨素溶于去離子水中，配制成1g/L的硫酸軟骨素溶液，將硫酸軟骨素溶液加入到上述層析柱中，然后收集層析柱流出的液體，置于-80℃冷凍干燥機中冷凍干燥，得硫酸軟骨素-四丁基銨化合物（CS-TBA）；將得到的硫酸軟骨素-四丁基銨化合物（CS-TBA）溶解于二甲亞砜中，配制成30g/L的溶液，按硫酸軟骨素-四丁基銨化合物（CS-TBA）、4-二甲氨基吡啶與縮水甘油基甲基丙烯酸酯的質量比為1：1：0.1，加入4-二甲氨基吡啶和縮水甘油基甲基丙烯酸酯，在50~60℃的條件下反應48h，旋轉蒸發(fā)去除剩余的溶劑，得到甲基丙烯酸化硫酸軟骨素；所述的離子交換樹脂為50WX8型離子交換樹脂，購自Sigma試劑公司；所述的四丁基溴化銨、4-二甲氨基吡啶和縮水甘油基甲基丙烯酸酯購自麥克林試劑公司；

（2）仿生打印材料的復合：將步驟（1）制備的甲基丙烯酸化硫酸軟骨素與聚丙交酯-己內酯-聚乙二醇-聚丙交酯-己內酯（PLCL-PEG-PLCL）三嵌段共聚物，按質量比為1:1~4溶于PBS磷酸鹽緩沖溶液中，在4℃下攪拌12 h，配制成質量濃度為10%的仿生打印材料溶液，備用；

（3）仿生水凝膠的打?。簩⒉襟E（2）配制的仿生打印材料溶液裝入37℃預熱的微量輸出泵，打印噴頭37℃預熱，接收平臺37℃預熱；設置每層的紫外照射時間為9s，通過輔助軟件CAD或solidWord建立打印模型，在RegenHU 3D 打印機上開始進行打印，打印完成后，用去離子水沖洗，得到軟骨修復水凝膠；所述的RegenHU 3D 打印機為光固化型3D打印機，打印噴頭孔徑為0.3 mm。

實施例5

對比例：為PVA水凝膠軟骨支架（參考申請?zhí)枮镃N201310015460.7所公開的一種基于PVA水凝膠軟骨支架的制備方法所制得）。

實驗組1~3：為實施例1～3所得的軟骨修復水凝膠，采用實施例4的方法制備而成。

以BSA為模型蛋白，利用BCA蛋白吸附能力測試法，評價采用實施例4的方法制備的實施例1～3與對比例的蛋白吸附能力。試驗結果如圖1 示。

蛋白吸附能力結果顯示實施例1~3的蛋白吸附能力均較對比例要高，這與利于生長因子和營養(yǎng)物質在其上黏附，為細胞在其上面生長提供一個良好的微環(huán)境。而且實施例1~3得到的具有誘導修復作用的軟骨修復水凝膠其蛋白吸附能力與甲基丙烯酸化硫酸軟骨素在水凝膠中所占的比例呈正相關。

實施例6

對比例：為PVA水凝膠軟骨支架（參考申請?zhí)枮镃N201310015460.7所公開的一種基于PVA水凝膠軟骨支架的制備方法所制得）。

實驗組1~3：為實施例1～3所得的軟骨修復水凝膠，采用實施例4的方法制備而成。

陰性組：成骨細胞MG63。

將上述采用實施例4的方法制備的實施例1～3與對比例進行細胞毒性評價實驗，按國標GB/T 16886.5-2003進行實驗。實驗結果如圖2所示。

細胞毒性檢測結果顯示：以陰性組為參照，實施例1~3所得的軟骨修復水凝膠在與成骨細胞MG63共培養(yǎng)3天和7天后，其對應的細胞相對增殖率均在95%以上，細胞毒性評級為0級，證明其具有良好的細胞形容性；而對比例與人成纖維細胞共培養(yǎng)3天和7天后，其對應細胞相對增殖率均在85%左右，細胞毒性評級為1級，無明顯的細胞毒性。

此外，隨著共培養(yǎng)時間的延長，實施例1~3所得的軟骨修復水凝膠的細胞相對增殖率均有明顯提高。如圖2所示，實施例1~3所得的軟骨修復水凝膠在共培養(yǎng)7天后，其細胞相對增殖率均較陰性組要高（均高于120%）。由此證明，采用本發(fā)明公開的制備方法所制得的軟骨修復水凝膠具有促進成骨細胞MG63的生長，有利于新的軟骨組織的生成。

實施例7

對比例：為PVA水凝膠軟骨支架（參考申請?zhí)枮镃N201310015460.7所公開的一種基于PVA水凝膠軟骨支架的制備方法所制得）。

實驗組1~3：為實施例1～3所得的軟骨修復水凝膠，采用實施例4的方法制備而成。

將上述采用實施例4的方法制備的實施例1～3與對比例分別與MG-63（人成骨肉瘤細胞）進行共培養(yǎng)7天后對其堿性磷酸酶和骨鈣蛋白值進行檢測，比較實驗組和對比例的骨誘導能力。實驗結果如圖3和4所示。

堿性磷酸酶（alkaline phosphate ALP）和骨鈣蛋白（osteocaltin OCN）均是分化成骨細胞的標志物，能促進骨基質的礦化。從圖3和4可知，與對比例相比，實施例1~3的ALP值和骨鈣蛋白含量均明顯較對比例要高。由此可見，本發(fā)所制備的軟骨修復水凝膠具有較高的骨誘導能力，可以促進軟骨組織的誘導再生。

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定；對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉；凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明權利要求的保護范圍之內。