本發(fā)明涉及光學(xué)光聲成像領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及了一種集光學(xué)和光聲于一體的、以核酸納米結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)自組裝的雙模態(tài)納米分子影像探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是一種嚴(yán)重危害人類健康的重要疾病，是威脅人類生命的頭號(hào)殺手。面對(duì)全球惡性腫瘤發(fā)生率和死亡率的不斷攀升，以及目前診斷和治療方法的局限性，發(fā)展高效低毒的診療一體化治療方法已成為迫在眉睫的重大問題。如何有效的利用較小侵入性且高靈敏度的分子影像手段進(jìn)行惡性腫瘤的早期篩查和切除術(shù)中導(dǎo)航，如何進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)腫瘤診斷與治療一體化，是現(xiàn)今癌癥研究中的熱點(diǎn)。

分子探針是成像成功的關(guān)鍵，它的合成和檢測是分子影像學(xué)研究中最熱門、最前沿的問題之一。而實(shí)際上，人們對(duì)探針的研究，沒有一種完美的影像技術(shù)能夠提供檢測對(duì)象的所有信息，任何一種影像技術(shù)都存在自身優(yōu)缺點(diǎn)；傳統(tǒng)的分子探針中，同樣也沒有一種能夠提供關(guān)于組織的所有結(jié)構(gòu)、功能和分子信息。為了克服這些問題，人們開始研究多模態(tài)分子探針，使得在診斷、治療和監(jiān)測等方面可以獲得全方位的信息，必將成為未來進(jìn)行體內(nèi)成像的重要工具。相對(duì)于傳統(tǒng)高損傷的手術(shù)治療和高毒性的放化療治療策略，利用納米探針在活體進(jìn)行光學(xué)(Optical imaging)及光聲成像(Photoacoustic imaging)指導(dǎo)下的雙模態(tài)的癌癥診療一體化策略，以其對(duì)腫瘤較好的療效和對(duì)機(jī)體較小的侵入損傷因而具有極其重要的應(yīng)用前景。

核酸納米材料具有結(jié)構(gòu)精確可控、易于化學(xué)修飾、生物可降解等特點(diǎn)，是一種很有潛力的抗腫瘤分子影像探針，在藥物高效靶向運(yùn)輸、多功能復(fù)合診療平臺(tái)等方面有非常廣闊的應(yīng)用前景。研制高效、低毒、靶向、多功能的核酸納米結(jié)構(gòu)作為運(yùn)輸載體，有望為開發(fā)新一代抗腫瘤藥物運(yùn)輸系統(tǒng)提供新思路、新途徑和新手段，具有重大的實(shí)際意義。DNA折紙(DNA origami)是一種新穎而獨(dú)特的DNA自組裝納米技術(shù)，為核酸納米材料的制備提供了一個(gè)新的思路，現(xiàn)在被廣泛用來從生物大分子脫氧核糖核酸(DNA)自下而上(Bottom-up)的制作各種納米尺度的二維和三維的DNA圖案和形狀，它是利用一條長的單鏈核苷酸序列與若干條短的寡核苷酸序列通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交形成預(yù)先設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)，通過這項(xiàng)技術(shù)，可以簡單方便的制備結(jié)構(gòu)復(fù)雜的二維或三維DNA納米材料。因此，研制高效、低毒、靶向、可控的DNA折紙納米結(jié)構(gòu)作為藥物運(yùn)輸載體，具有非常重大的實(shí)際意義。

貴金屬納米材料，由于其具有光聲的特點(diǎn)而引起了廣泛關(guān)注并成為了腫瘤治療方面的另一研究熱點(diǎn)，其中金納米棒最具有一定的代表意義。金納米棒近紅外區(qū)域具有良好的等離子共振效應(yīng)(Surface Plasmon Resonance，SPR)，能夠被可見光或者近紅外光誘導(dǎo)并將其轉(zhuǎn)化為熱量釋放出來，可用來進(jìn)行光熱治療；利用其等離子共振峰峰波長相近的雙光子激光進(jìn)行激發(fā)則產(chǎn)生雙光子熒光和光聲信號(hào)，可被用作活體診斷成像的造影劑。盡管利用貴金屬納米顆粒及其組裝體作為造影劑進(jìn)行光聲成像和光熱治療有諸多的好處，如制備簡單、形貌豐富、尺寸可控以及生物安全性等優(yōu)勢，但應(yīng)用于腫瘤的早期檢測和治療的實(shí)踐中，仍然存在許多的問題。如貴金屬納米材料結(jié)構(gòu)大多尺寸較小，對(duì)于腫瘤區(qū)域沒有主動(dòng)選擇性，限制其進(jìn)一步應(yīng)用。如果能夠?qū)①F金屬納米顆?；蚱浣M裝結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效裝載，并對(duì)納米載體進(jìn)行腫瘤細(xì)胞和組織靶向功能修飾，則既可以提高造影材料對(duì)腫瘤組織的有效遞送，又可以避免納米材料對(duì)正常組織和細(xì)胞的傷害，從而有效殺傷腫瘤；還可在同一納米載體上同時(shí)裝載成像試劑/化療藥物等，最終實(shí)現(xiàn)高效、低毒、靶向、影像探針導(dǎo)航的診療一體化納米平臺(tái)。

量子點(diǎn)(Quantum Dot)是20世紀(jì)90年代提出來的一個(gè)新概念。量子點(diǎn)一般為球形或類球形，又可稱為納米晶，是一種由II-VI族或III-V族元素組成的納米顆粒。量子點(diǎn)的粒徑一般介于1-10nm之間，由于電子和空穴被量子限域，連續(xù)的能帶結(jié)構(gòu)變成具有分子特性的分立能級(jí)結(jié)構(gòu)，受激后可以發(fā)射熒光。作為一種新穎的半導(dǎo)體納米材料，與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料相比，量子點(diǎn)具有許多獨(dú)特的納米性質(zhì)和多種優(yōu)勢，如吸收光譜寬、發(fā)射光譜窄且對(duì)稱；生物相容性好；具有很好的光穩(wěn)定性，在較長時(shí)間的激發(fā)光照射下熒光強(qiáng)度都不會(huì)降低，因此，量子點(diǎn)可用于高靈敏度的檢測和熒光顯微鏡下長時(shí)間持續(xù)的觀測，使其作為一種新型的熒光探針在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用得到了快速的發(fā)展?？偠灾?，量子點(diǎn)具有激發(fā)光譜寬且連續(xù)分布，而發(fā)射光譜窄而對(duì)稱，顏色可調(diào)，光化學(xué)穩(wěn)定性高，熒光壽命長等優(yōu)越的熒光特性，是一種理想的熒光探針。量子點(diǎn)特殊的光學(xué)性質(zhì)使得它在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物篩選、生物大分子相互作用等研究中有極大的應(yīng)用前景?；诹孔有?yīng)，量子點(diǎn)在太陽能電池，發(fā)光器件，光學(xué)生物標(biāo)記等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

如何構(gòu)建可控的微納米結(jié)構(gòu)作為光學(xué)及光聲成像的分子影像探針是現(xiàn)今急需解決的核心問題之一，該探針需滿足形態(tài)和粒徑容易控制、化學(xué)結(jié)構(gòu)容易修飾、生物相容性較好等必要條件。恰恰DNA納米材料具有結(jié)構(gòu)精確可控、易于功能化修飾、可生物降解等特點(diǎn)符合這些要求，是一種很有潛力的生物型材料，在構(gòu)建功能型材料等方面有非常好的優(yōu)勢。DNA修飾后的金納米棒，通過DNA之間的相互雜交連接到DNA折紙結(jié)構(gòu)上，此外，量子點(diǎn)利用鏈霉親和素與生物素相互反應(yīng)連接到DNA折紙結(jié)構(gòu)上。

通過上述分析，前期已有的發(fā)明都有關(guān)于核酸納米結(jié)構(gòu)用于藥物載體、小動(dòng)物光熱治療，但是目前尚無將核酸納米材料作為載體將金納米棒和量子點(diǎn)結(jié)合在一起的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種集光學(xué)和光聲于一體的雙模態(tài)分子影像探針及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所提供的雙模態(tài)分子影像探針是集光學(xué)成像和光聲成像于一體的，其利用核酸納米結(jié)構(gòu)將金納米棒和量子點(diǎn)結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)了雙模態(tài)分子影像探針在動(dòng)物水平上的光學(xué)及光聲成像效果。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種集光學(xué)和光聲于一體的雙模態(tài)分子影像探針，該雙模態(tài)分子影像探針為核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物。

本發(fā)明提供的雙模態(tài)分子影像探針能夠促進(jìn)光敏成分在腫瘤組織中的富集從而更有效的進(jìn)行活體光聲成像，同時(shí)由于其負(fù)載的量子點(diǎn)使其具有良好的光學(xué)成像質(zhì)量，從而實(shí)現(xiàn)了集光學(xué)和光聲成像于一體。

本發(fā)明中，所述核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物是由核酸納米結(jié)構(gòu)作為載體將金納米棒和量子點(diǎn)結(jié)合在一起，從而得到該復(fù)合物。

本發(fā)明中，所述核酸納米結(jié)構(gòu)是利用DNA折紙技術(shù)構(gòu)建的二維和/或三維納米結(jié)構(gòu)，其具體可以是通過腳手架鏈(scaffold chains)與輔助折疊的訂書釘鏈(staple strands)進(jìn)行雜交而自組裝形成的核酸納米結(jié)構(gòu)，所述腳手架鏈與所述訂書釘鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交。

其中所述腳手架鏈可選自M13噬菌體基因組DNA、基于M13噬菌體基因組DNA進(jìn)行改造的各種單鏈環(huán)狀DNA、Lambda噬菌體基因組DNA、利用點(diǎn)突變技術(shù)和位點(diǎn)-延伸非依賴克隆(SLIC)技術(shù)從給定質(zhì)粒大規(guī)模生產(chǎn)長度可調(diào)的單鏈環(huán)狀DNA鏈、通過PCR得到的M13噬菌體基因組DNA片段、Lambda噬菌體基因組DNA片段和利用體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA片段中的一種或至少兩種的混合物。除此之外，還可使用其它腳手架鏈，只要其能夠滿足特定位點(diǎn)上的堿基互補(bǔ)配對(duì)，使訂書釘鏈能夠輔助腳手架鏈進(jìn)行折疊自組裝形成核酸納米結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，所述腳手架鏈為M13噬菌體基因組DNA。

所述輔助折疊的訂書釘鏈為人工合成的寡核苷酸序列，其選取5-20個(gè)位點(diǎn)延伸出了捕獲序列，其捕獲序列與后續(xù)DNA修飾金納米棒采用的序列互補(bǔ)。

由此可見，優(yōu)選的核酸納米結(jié)構(gòu)為M13噬菌體基因組DNA與人工合成的寡核苷酸序列通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交自組裝而形成。

優(yōu)選地，使用DNA折紙技術(shù)可以將所述核酸納米結(jié)構(gòu)構(gòu)建成三角形、長方形、納米管狀、四面體、巴基球形、納米片狀、帶狀或籠狀。

本發(fā)明中，所述金納米棒為表面進(jìn)行寡核苷酸序列修飾的金納米棒；除了該金納米棒以外，還可以采用金納米殼、表面包銀的金納米棒或金納米籠等。

所述金納米棒可使用本領(lǐng)域內(nèi)任意已知方法制備。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述金納米棒為表面進(jìn)行巰基化DNA修飾的金納米棒。

本發(fā)明中所述金納米棒與所述核酸納米結(jié)構(gòu)通過寡核苷酸序列雜交偶聯(lián)。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解，本發(fā)明的金納米棒的制備方法并不必然依賴于上述詳細(xì)工藝及參數(shù)，此處給出的僅僅是較優(yōu)的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)其經(jīng)驗(yàn)制備所需的金納米棒。

第二方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述集光學(xué)和光聲于一體的雙模態(tài)分子影像探針的制備方法，其包括以下步驟：

(1)制備核酸納米結(jié)構(gòu)；

(2)制備金納米棒；

(3)將步驟(1)得到的核酸納米結(jié)構(gòu)與步驟(2)得到的金納米棒混合，以梯度循環(huán)的方式降溫退火，得到負(fù)載有金納米棒的核酸納米結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行電泳除去過量的金納米棒；

(4)將量子點(diǎn)與步驟(3)得到的純化后的負(fù)載有金納米棒的核酸納米結(jié)構(gòu)混合，經(jīng)孵育，得到核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物。

在本發(fā)明所述集光學(xué)和光聲于一體的雙模態(tài)分子影像探針的制備方法中，之所以能形成核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物，其中有兩個(gè)重要的參數(shù)起到十分關(guān)鍵的作用，一是核酸納米結(jié)構(gòu)與金納米棒的摩爾比，二是量子點(diǎn)與負(fù)載有金納米棒的核酸納米結(jié)構(gòu)的摩爾比，尤其以后者為主。也就是說，本發(fā)明構(gòu)成復(fù)合物的三種成分之間具有一定的配比關(guān)系，只有當(dāng)同時(shí)滿足核酸納米結(jié)構(gòu)與金納米棒的摩爾比為1:(1-3)以及量子點(diǎn)與負(fù)載有金納米棒的核酸納米結(jié)構(gòu)的摩爾比為(3-5):1時(shí)，其才能制備得到核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物，并使得該復(fù)合物具有相比單獨(dú)采用這三種成分或任意兩種成分得到的復(fù)合物，具有更優(yōu)異的光聲學(xué)吸收對(duì)比增強(qiáng)效果以及更好的光學(xué)成像質(zhì)量。

優(yōu)選地，本發(fā)明采用核酸納米結(jié)構(gòu)與金納米棒的摩爾比為1:2以及量子點(diǎn)與負(fù)載有金納米棒的核酸納米結(jié)構(gòu)的摩爾比為4:1的配比關(guān)系。由于在溶液狀態(tài)下量子點(diǎn)和金納米棒會(huì)存在相互作用的影響，容易導(dǎo)致金納米棒高效地淬滅量子點(diǎn)，因此本發(fā)明對(duì)量子點(diǎn)與金納米棒的摩爾比進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)二者的摩爾比為2:1時(shí)，其不僅保證了量子點(diǎn)與金納米棒的DNA折紙復(fù)合結(jié)構(gòu)完全組裝，還保證了金納米棒不會(huì)將量子點(diǎn)淬滅。

本發(fā)明的步驟(1)中，所述核酸納米結(jié)構(gòu)的制備方法包括以下步驟：

將訂書釘鏈混合溶液加入到腳手架鏈溶液中，所述腳手架鏈與訂書釘鏈的摩爾比為1:(2-50)，混勻；以90-100℃為起始溫度進(jìn)行降溫退火至15-25℃，整個(gè)過程持續(xù)10h以上，制得所述核酸納米結(jié)構(gòu)。

所述腳手架鏈與訂書釘鏈的摩爾比為1:(2-50)，例如1:2、1:5、1:8、1:10、1:12、1:15、1:18、1:20、1:25、1:28、1:30、1:40或1:50，優(yōu)選為1:(5-30)，進(jìn)一步優(yōu)選為1:(10-25)。

所述降溫退火的起始溫度為90-100℃，例如90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或100℃，優(yōu)選為93-96℃，進(jìn)一步優(yōu)選為95℃。

所述降溫退火的終點(diǎn)溫度為15-25℃，例如15℃、18℃、19℃、20℃、22℃或25℃，優(yōu)選為18-22℃，進(jìn)一步優(yōu)選為20℃。

所述降溫退火過程的持續(xù)時(shí)間為10h以上，例如10h、12h、14h、15h、18h、20h、25h、26h或28h，優(yōu)選為10-26h，進(jìn)一步優(yōu)選為12-24h。

本發(fā)明步驟(2)中，所述金納米棒通過以下方法制備：利用晶種誘導(dǎo)生長法制備金納米棒；使用十六烷基三甲基溴化銨進(jìn)行修飾；使用合成的巰基化寡核苷酸序列替代十六烷基三甲基溴化銨，由此完成金納米棒的DNA表面修飾。

本發(fā)明步驟(3)中，所述核酸納米結(jié)構(gòu)與金納米棒的摩爾比為1:(1-3)，例如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5或1:3，優(yōu)選為1:2。

所述步驟(3)中的降溫退火為從40-45℃(例如40℃、41℃、42℃、43℃或45℃)，逐漸降溫退火至20-25℃(例如20℃、21℃、22℃、23℃或25℃)，此退火降溫過程為一個(gè)循環(huán)，共30-60個(gè)循環(huán)(例如循環(huán)數(shù)為30、32、35、40、45、50、55或60)，優(yōu)選30-45個(gè)循環(huán)，每攝氏度℃為一個(gè)梯度，每梯度保持3-5min(例如3min、3.5min、4min、4.5min或5min)。

所述步驟(3)中的電泳條件為：0.5-1％瓊脂糖膠、電泳環(huán)境溫度4-10℃、電泳緩沖液為0.5-1×TBE緩沖液并含5-11mM Mg²⁺、電泳電壓為10-15V/cm、且電泳時(shí)間為30-50min。

本發(fā)明步驟(4)中，所述量子點(diǎn)與負(fù)載有金納米棒的核酸納米結(jié)構(gòu)的摩爾比為(3-5):1，例如3:1、3.5:1、4:1、4.5:1或5:1，優(yōu)選為4:1。

所述步驟(4)中的孵育在室溫下進(jìn)行，優(yōu)選在18-25℃下進(jìn)行。

所述步驟(4)中的孵育的時(shí)間為1-3h，例如1h、1.5h、2h、2.5h或3h，優(yōu)選為2h。

第三方面，本發(fā)明還提供了如第一方面所述的集光學(xué)和光聲于一體的雙模態(tài)分子影像探針在制備活體光學(xué)和光聲成像造影劑或腫瘤手術(shù)導(dǎo)航探針中的應(yīng)用。

所述腫瘤為卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞癌、頭頸癌、食管癌、肝癌、肺腺細(xì)胞癌、前列腺癌或非何金氏淋巴瘤中的一種或至少兩種的組合。

與現(xiàn)有技術(shù)方案相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：

本發(fā)明所提供的雙模態(tài)分子影像探針是集光學(xué)成像和光聲成像于一體的，其利用核酸納米結(jié)構(gòu)將金納米棒和量子點(diǎn)結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)了雙模態(tài)分子影像探針在動(dòng)物水平上的光學(xué)及光聲成像效果。

附圖說明

圖1為DNA折紙納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合結(jié)構(gòu)電鏡圖；

圖2為注射核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物(Orgami-AuNR-QD)，核酸納米結(jié)構(gòu)、金納米棒與量子點(diǎn)混合物(Origami+AuNR+QD)樣品后裸鼠的光學(xué)成像結(jié)果；

圖3為核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物(Orgami-AuNR-QD)，核酸納米結(jié)構(gòu)、金納米棒與量子點(diǎn)混合物(Origami+AuNR+QD)以及游離金納米棒樣品(AuNR)的仿體光聲成像結(jié)果，其中圖3-A為核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物以及核酸納米結(jié)構(gòu)、金納米棒與量子點(diǎn)混合物樣品的仿體光聲成像結(jié)果，其每個(gè)成像結(jié)果的左側(cè)圓環(huán)為核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物樣品，右側(cè)為核酸納米結(jié)構(gòu)、金納米棒與量子點(diǎn)混合物樣品，圖3-B為游離金納米棒樣品的仿體光聲成像結(jié)果，其左側(cè)和中間的成像結(jié)果分別包括兩個(gè)濃度的游離金納米棒樣品，右側(cè)的成像結(jié)果中均為0.375nM的游離金納米棒樣品；

圖4為核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物(Orgami-AuNR-QD)，核酸納米結(jié)構(gòu)、金納米棒與量子點(diǎn)混合物(Origami+AuNR+QD)以及游離金納米棒樣品(AuNR)的光聲成像數(shù)據(jù)的分析。

下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。但下述的實(shí)例僅僅是本發(fā)明的簡易例子，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

為更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制性的實(shí)施例如下：

器材：Mastercycler Pro梯度PCR儀(Eppendorf，德國)，5810R小型高速離心機(jī)(Eppendorf，德國)，UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)(島津，日本)，透射電鏡(日立)，雙光子熒光顯微鏡(Olympus，日本)，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)，超純水處理系統(tǒng)(Miilipore Reference-Q，德國)，等離子處理機(jī)(Emitch K100X，美國)。

原料：短鏈核苷酸序列(訂書釘鏈，Nature，2006，440，297-302)購自上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司，M13噬菌體基因組DNA購自New England Biolabs公司。量子點(diǎn)購自美國Life Technology公司。CTAB、氯金酸、硼氫化鈉、硝酸銀等其他原料均購自美國Sigma-Aldrich公司。

試劑：實(shí)驗(yàn)中所用的緩沖溶液有TAE/Mg²⁺緩沖溶液(pH 8.3)和PBS緩沖溶液(pH 7.4)。其中，1×TAE/Mg²⁺緩沖溶液(pH 8.3)的組分為：4×10^-2mol/L Tris，2×10^-2mol/L乙酸，2.0×10^-3mol/L EDTA和1.25×10^-2mol/L醋酸鎂；1×PBS緩沖溶液(pH 7.4)的組成為：136.9×10^-3mol/L(8.00g/L)NaCl，2.68×10^-3mol/L(0.20g/L)KCl，9.75×10^-3mol/L(1.56g/L)Na₂HPO₄·H₂O和1.47×10^-3mol/L(0.20g/L)KH₂PO₄；這些緩沖溶液所用的試劑均為分析純，購自Sigma-Aldrich公司。

實(shí)施例1制備核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物

(1)核酸納米結(jié)構(gòu)的合成

將終濃度為10nM的M13噬菌體基因組DNA和終濃度為100nM的訂書釘鏈及捕獲訂書釘鏈混合在終濃度為1×TAE/Mg²⁺(pH＝8.3)的溶液中，最終獲得混合溶液的體積為100μL。控制上述混合溶液的溫度從95℃逐步退溫降火至20℃，整個(gè)降溫過程控制在12小時(shí)以上，從而獲得既定的核酸納米結(jié)構(gòu)。

(2)利用晶種誘導(dǎo)生長法，表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，還原劑為抗壞血酸，通過控制AgNO₃濃度來制備金納米棒(參見Chem Mater,2003,15(10):1957-62.)。具體方法如下：

(a)晶種的合成：取7.5mL濃度為100mM的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，50μL濃度為2％(w/v)的HAuCl₄加入至20mL圓底燒瓶中。攪拌均勻后，迅速加入濃度為6mM預(yù)冷的NaBH₄1000μL，再次攪拌均勻，約2min，溶液顏色逐漸由無色變?yōu)樽攸S色后，停止攪拌，將燒瓶移至30℃水浴中靜置2小時(shí)，備用。

(b)金納米棒的生長：在裝有10mL濃度為100mM的CTAB的20mL圓底燒瓶中加入85μL濃度為2％(w/v)的HAuCl₄，液體顏色為橙色。攪拌均勻后，在該混合液中加入80μL濃度為10mM的AgNO₃，緩慢攪拌。再次攪拌均勻后，繼續(xù)在高速攪拌的狀態(tài)下加入60μL濃度為100mM的抗壞血酸，溫柔振蕩至溶液為無色。最后加入20μL步驟(a)合成的晶種溶液。攪拌均勻后，將溶液置于30℃溫水浴中靜置10小時(shí)，溶液為紫紅色。

(c)金納米棒的純化：將合成的金納米棒轉(zhuǎn)移至15mL離心管內(nèi)(8000rpm，30分鐘)進(jìn)行超速離心。倒掉上清溶液后，在離心管內(nèi)加入10mL去離子水重新分散，再次以8000rpm的條件離心30min，反復(fù)數(shù)次后保留底部沉淀，即金納米棒，加入20μL去離子水分散。通過紫外-可見分光光度計(jì)測定所獲得的金納米棒的濃度。

(d)利用巰基化DNA修飾金納米棒，具體方法如下：

取200倍過量的TCEP(200mM)試劑對(duì)濃度為100μM巰基化DNA(ACGCTTTTTTTTTTTTTTT-SH，100μM)進(jìn)行還原，反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)，然后通過G-25體積排阻柱離心除去過量的TCEP。配制修飾緩沖溶液(89mM Tris base、89mM硼酸、2mM EDTA、500mM NaCl和0.01％SDS)，用pH計(jì)對(duì)溶液pH值進(jìn)行監(jiān)測，保證溶液pH值為5-6后，加入濃度高于金納米棒1000倍的還原后的巰基化DNA，將上述溶液混合均勻后，在高效振動(dòng)時(shí)加入金納米棒，混合均勻后，靜置于30℃水浴中過夜備用。

對(duì)于修飾了巰基化DNA的金納米棒，放入離心機(jī)內(nèi)進(jìn)行離心(8000rpm，30min)，回收所得的金納米棒，加入適量去離子水，重復(fù)上述離心過程，洗去過量的DNA。

(3)DNA折紙結(jié)構(gòu)與金納米棒的組裝

將經(jīng)過PCR儀器程序控溫組裝后的核酸納米結(jié)構(gòu)，利用離心柱(100kDa)純化去除過量的DNA訂書釘鏈和捕獲鏈。將已修飾的金納米棒和DNA折紙結(jié)構(gòu)以2:1的比例進(jìn)行混合，再次置于PCR儀器內(nèi)對(duì)其進(jìn)行控溫退火，控溫條件為：45℃-25℃為一個(gè)循環(huán)，每℃保持3min，重復(fù)20個(gè)循環(huán)以上，以保證修飾在金納米棒上的DNA分子可以同DNA折紙結(jié)構(gòu)上的捕獲訂書釘鏈雜交效果。

(4)量子點(diǎn)與載有金納米棒的DNA折紙復(fù)合結(jié)構(gòu)的組裝

將4倍過量的量子點(diǎn)與載有金納米棒的DNA折紙復(fù)合結(jié)構(gòu)混合，在室溫的條件下即可，孵育2小時(shí)，以保證在室溫條件下生物素和鏈霉親和素充分反應(yīng)。

以核酸納米結(jié)構(gòu)為載體的金納米棒和量子點(diǎn)組裝產(chǎn)物的提純

電泳純化：制備1％的瓊脂糖(1×TBE緩沖溶液，Agrose試劑)，在加熱條件下溶解，加入2.5μL溴化乙錠對(duì)其預(yù)先染色。將修飾了DNA的金納米棒、DNA折紙結(jié)構(gòu)、DNA-金納米棒-量子點(diǎn)加入至所制備的1％瓊脂糖凝膠孔中，對(duì)上述產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，電泳所需離子環(huán)境為0.5×TBE緩沖溶液，10mM Mg²⁺。電泳所需要的電壓為85V，45min。在白光和紫外光下分別確定組合產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中的位置，并對(duì)其進(jìn)行拍照存儲(chǔ)，切下目標(biāo)條帶，利用凝膠純化柱在4℃以離心的方法得到純凈濃縮的產(chǎn)物。

采用透射電子顯微鏡對(duì)以核酸納米結(jié)構(gòu)為載體的量子點(diǎn)和金納米棒組裝產(chǎn)物的表征

碳支持膜(銅網(wǎng))經(jīng)等離子體處理機(jī)輝光濺射進(jìn)行處理，滴加10μL上述純化后的復(fù)合結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物，沉積至銅網(wǎng)10min后，吸棄多余液體，再次滴加濃度為0.7％的醋酸雙氧鈾對(duì)銅網(wǎng)進(jìn)行負(fù)染，沉積30秒鐘后，濾紙吸干醋酸雙氧鈾，待干燥后用透射電鏡觀察樣品。以型號(hào)為HT7700的投射電子顯微鏡在80kV的條件下，對(duì)產(chǎn)物拍照表征。

如圖1所示，圖1為DNA折紙納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合結(jié)構(gòu)電鏡圖，從透射電子顯微鏡可見，DNA折紙納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合結(jié)構(gòu)形成良好，在組裝和純化過程的情況下，核酸納米結(jié)構(gòu)仍舊能夠保持完好的形貌，無不利影響。

實(shí)施例2核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)的活體光學(xué)成像

將實(shí)施例1制備得到的核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物和對(duì)照組核酸納米結(jié)構(gòu)、金納米棒與量子點(diǎn)混合物兩組樣品各取100μL在5-6周雌性BALB/C裸鼠背部皮下進(jìn)行給藥處理，注射后利用小動(dòng)物光學(xué)成像系統(tǒng)對(duì)裸鼠進(jìn)行活體光學(xué)成像。

如圖2所示為注射樣品后裸鼠的光學(xué)成像結(jié)果。由圖2可見，將量子點(diǎn)組裝在載有金納米棒的核酸納米結(jié)構(gòu)上的光學(xué)信號(hào)相對(duì)于沒有進(jìn)行組裝而只是將核酸納米結(jié)構(gòu)、金納米棒與量子點(diǎn)混合的情況下的光學(xué)信號(hào)顯著，這說明經(jīng)組裝后，核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物相比核酸納米結(jié)構(gòu)、金納米棒與量子點(diǎn)混合物具有更強(qiáng)的光學(xué)信號(hào)。

實(shí)施例3核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物的仿體光聲成像

圖3所示為核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物、核酸納米結(jié)構(gòu)、金納米棒與量子點(diǎn)混合物以及游離金納米棒樣品的仿體光聲成像結(jié)果，分三組進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，分別為金納米棒組(100μL)，核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)(100μL)復(fù)合物和核酸納米結(jié)構(gòu)、金納米棒與量子點(diǎn)的混合物(100μL)加入到仿體內(nèi)進(jìn)行光聲實(shí)驗(yàn)，分別在濃度為6nM、3nM、1.5nM、0.75nM、0.375nM的情況下對(duì)光聲信號(hào)進(jìn)行采集。其中圖3-A為核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物以及核酸納米結(jié)構(gòu)、金納米棒與量子點(diǎn)混合物樣品的仿體光聲成像結(jié)果，其每個(gè)成像結(jié)果的左側(cè)圓環(huán)為核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物樣品，右側(cè)為核酸納米結(jié)構(gòu)、金納米棒與量子點(diǎn)混合物樣品，圖3-B為游離金納米棒樣品的仿體光聲成像結(jié)果，其左側(cè)和中間的成像結(jié)果分別包括兩個(gè)濃度的游離金納米棒樣品，右側(cè)的成像結(jié)果中均為0.375nM的游離金納米棒樣品。

圖4為對(duì)光聲成像數(shù)據(jù)的分析，可以觀察到與單獨(dú)金納米棒樣品、核酸納米結(jié)構(gòu)、金納米棒與量子點(diǎn)混合物類似，核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物信號(hào)可以較好的吻合，該結(jié)果進(jìn)一步證明了核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒-量子點(diǎn)復(fù)合物是一種良好的納米探針材料，可以進(jìn)行實(shí)時(shí)的光聲成像，有望為腫瘤檢測雙模態(tài)分子影像探針提供基礎(chǔ)，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。