本發(fā)明涉及中醫(yī)藥制備技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種雷公藤作藥引的中藥制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以累及周圍關(guān)節(jié)為主的慢性、多系統(tǒng)性、炎癥性自身免疫病。其臨床表現(xiàn)主要為對稱性、持續(xù)性關(guān)節(jié)腫脹和疼痛，常伴有晨僵。病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、血管翳形成，并出現(xiàn)關(guān)節(jié)和軟骨的破壞。全球有1％的人受此病困擾，導(dǎo)致嚴(yán)重功能障礙、永久性殘疾，且死亡率有上升趨勢。目前國際上治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的常用藥物有非甾體抗炎藥、改善病情抗風(fēng)濕藥、生物制劑、糖皮質(zhì)激素。以上藥物雖然療效明確，但其不良反應(yīng)較多，如胃腸道癥狀、肝腎功能損害以及可能增加的心血管和感染等不良事件。中醫(yī)藥治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎最為突出的單味中藥當(dāng)推雷公藤。雷公藤是衛(wèi)矛科植物雷公藤的根、葉及花，藥性苦、辛、寒，有大毒，主要功效為祛風(fēng)濕、活血通絡(luò)、消腫止痛。
雷公藤及其相關(guān)制劑作為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的有效藥物，在臨床上已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。但雷公藤具有一定的毒性，有效治療量與最小中毒量比較接近。治療劑量范圍內(nèi)發(fā)生不良反應(yīng)較多，對消化、泌尿、生殖、心血管、骨髓及血液等系統(tǒng)均有明確的損害。近年來對于關(guān)于雷公藤及其制劑在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的文獻(xiàn)報(bào)道中，主要是分別針對雷公藤的炮制減毒工藝、制劑劑型改良、復(fù)方中藥配伍、聯(lián)合西藥和針灸配合等方面展開，但未從根本上解決臨床用雷公藤治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的毒副作用。
有鑒于此，特提出本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一目的在于提供一種雷公藤作藥引的中藥制劑，以解決現(xiàn)有雷公藤在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎毒副作用大的問題，所述的雷公藤作藥引的中藥制劑，具有有效率高、不良反應(yīng)率低、毒性弱等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的第二目的在于提供一種所述的雷公藤作藥引的中藥制劑的制備方法，該方法用陳皮和雷公藤的提取液溶化復(fù)方中藥制劑，然后加入飲用白酒，制成酒劑，具有方便、簡單、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，適合批量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。
本發(fā)明的第三目的在于提供一種所述的雷公藤作藥引的中藥制劑在制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，尤其是中醫(yī)辨證為風(fēng)寒濕痹型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
一種雷公藤作藥引的中藥制劑，按照重量份數(shù)計(jì)，包括由300～400份雷公藤和100～200份陳皮制成的藥引液和復(fù)方中藥制劑；
所述復(fù)方中藥制劑，包括按照重量份數(shù)計(jì)的如下組份：
羌活30～50份，獨(dú)活90～110份，海風(fēng)藤50～70份，秦艽40～60份，桂枝70～90份，當(dāng)歸50～70份，川芎40～60份，乳香10～30份，木香10～30份，甘草50～70份，防風(fēng)50～70份，白芷50～70份，淡附片50～70份，制川烏50～70份，細(xì)辛20～40份，防己50～70份，萆薢40～60份，薏苡仁90～110份，黃芪90～110份，炒白芍50～70份，桑寄生20～40份，牛膝20～40份，蜈蚣10～15份，烏梢蛇3～6份和地龍10～30份。
雷公藤，又叫黃藤、黃臘藤、菜蟲藥、紅藥、水莽草。味苦、辛，性涼，大毒。歸肝、腎經(jīng)。具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛、消腫止痛、解毒殺蟲之功效。但是，雷公藤有大毒，會使患者產(chǎn)生腹部不適、惡心或者腹瀉等癥狀，因此對其在使用的過程中應(yīng)須謹(jǐn)慎。
陳皮，味苦、辛，性溫。歸肺、脾經(jīng)。具有理氣健脾，燥濕化痰。與雷公藤同煮，可以有效降低雷公藤的毒性，并且將陳皮與雷公藤預(yù)先水提，有助于雷公藤中的有效成分析出，同時(shí)降低其毒性。
羌活，味辛、苦，性溫。入膀胱、腎經(jīng)。具有解表散寒、祛風(fēng)勝濕、止痛的功效。
獨(dú)活，味辛、苦，性微溫。歸腎、膀胱經(jīng)。具有祛風(fēng)除濕、散痹止痛的功效。
海風(fēng)藤，味辛、苦，性微溫。歸肝經(jīng)。具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、止痹痛的功效。
秦艽，味辛、苦，性平。歸胃、肝、膽經(jīng)。具有有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱的作用。
當(dāng)歸，味甘、辛，性溫。歸肝、心、脾經(jīng)。具有補(bǔ)血活血、潤腸通便的功效。
川芎，味辛，性溫。入肝、膽經(jīng)。具有行氣開郁、祛風(fēng)燥濕、活血止痛的功效。
乳香，味辛、苦，性溫。歸心、肝、脾經(jīng)。具有活血行氣止痛、消腫生肌的功效。
木香，味辛，苦；性溫。歸脾、大腸、三焦經(jīng)。具有行氣、止痛、健脾、消食的功效。
防風(fēng)，味辛、甘，性微溫。歸膀胱、肺、脾、肝經(jīng)。具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙的功效。
白芷，味辛，性溫。歸肺，脾，胃經(jīng)。具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿、祛風(fēng)止癢的功效。
淡附片，大辛、大熱。歸心、脾、腎經(jīng)，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、逐風(fēng)寒濕邪的功效。
制川烏，味辛、苦，性熱。歸心、肝、腎、脾經(jīng)。具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的功效。
細(xì)辛，味辛，性溫。歸心、肺、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)散寒、祛風(fēng)止痛、通竅、溫肺化飲的功效。
桂枝，樟科植物肉桂的干燥嫩枝。味辛、甘，性溫。歸肺、心、膀胱經(jīng)。具有發(fā)汗解表、散寒止痛、通陽化氣。
甘草，味甘，性平。歸心、肺、脾、胃經(jīng)。具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，的功效，此外還有調(diào)和諸藥，使各中藥藥效平衡的作用。另外，其清熱解毒的功效可以有效緩解雷公藤的毒性。
防己，味辛、苦，性寒。歸膀胱、肺經(jīng)。具有祛風(fēng)止痛、利水消腫的功效。
薏苡仁，別稱薏米。味甘、淡，性涼。歸脾、胃、肺經(jīng)。有利水滲透濕，健脾止瀉，除痹，排膿，解毒散結(jié)的作用。用于治療水腫、小便不利、脾虛泄瀉、濕痹拘攣、肺癰和腸癰。
萆薢，味苦、性平。歸腎、胃經(jīng)。具有利濕去濁、祛風(fēng)除痹的功效。
黃芪，性溫，味甘。歸肺、脾、肝、腎經(jīng)。具有補(bǔ)氣固表、托毒排膿、利尿、生肌的功效。
炒白芍，性味苦、酸，微寒。歸肝、脾經(jīng)。具有平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗的功效。
桑寄生，味苦、甘，性平。歸肝、腎經(jīng)。具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的作用。
牛膝，性味：苦、甘、酸，平。歸經(jīng)：歸肝、腎經(jīng)。具有逐瘀通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利尿通淋、引血下行的功效。
蜈蚣，辛，溫。歸肝經(jīng)。具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙，通絡(luò)止痛，攻毒散結(jié)的功效。
烏梢蛇，味甘，性平。入肺、脾、肝經(jīng)。具有祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)，止痙。
地龍，具有利尿、鎮(zhèn)痛、平喘、降壓、解熱、抗驚厥等作用，還可以通經(jīng)活絡(luò)、活血化瘀、預(yù)防治療心腦血管疾病作用。
本申請所提供的中藥制劑，采用雷公藤作為藥引，為了減弱雷公藤的毒性，采用陳皮與雷公藤進(jìn)行水提得到水提液，以降低毒性。在復(fù)合中藥制劑中，采用傳統(tǒng)治療風(fēng)濕病的中藥，如羌活、獨(dú)活、海風(fēng)藤、秦艽、蜈蚣和烏鞘蛇等，再輔以熱性藥物，散寒除濕，在既定份數(shù)內(nèi)，對風(fēng)寒濕痹型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，療效顯著。另外，搭配健脾開胃的中藥，歸經(jīng)胃、肝、腎、肺，在多方面養(yǎng)胃、排熱、利尿，從而降低雷公藤作用過程中的毒性，達(dá)到全面治療風(fēng)濕病的功效。其中，羌活、秦艽、白芷、淡附片和桂枝在本申請所提供的搭配范圍內(nèi)，具有很好的溫陽、散寒的功效。
優(yōu)選的，所述的雷公藤作藥引的中藥制劑，按照重量份數(shù)計(jì)，包括320～380份雷公藤和150～200份陳皮制成的藥引液和復(fù)方中藥制劑；
所述復(fù)方中藥制劑，包括按照重量份數(shù)計(jì)的如下組份：
羌活35～45份，獨(dú)活95～105份，海風(fēng)藤55～65份，秦艽45～55份，桂枝75～85份，當(dāng)歸55～65份，川芎45～55份，乳香15～25份，木香15～25份，甘草55～65份，防風(fēng)55～65份，白芷55～65份，淡附片55～65份，制川烏55～65份，細(xì)辛25～35份，防己55～65份，萆薢45～55份，薏苡仁95～105份，黃芪95～105份，炒白芍55～65份，桑寄生25～35份，牛膝25～35份，蜈蚣12～14份，烏梢蛇2～5份和地龍15～25份。
可以對中藥制劑的組份進(jìn)行優(yōu)選。
優(yōu)選的，所述雷公藤為雷公藤的地下部分帶皮的根。
地下部分的根，帶黃色根皮者，其皮含多種化學(xué)成分，作用力強(qiáng)，為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有效藥物。
優(yōu)選的，所述藥引液的制備方法包括以下步驟：
將雷公藤和陳皮加入雷公藤質(zhì)量10～12倍的水中浸泡，先用武火加熱至沸騰，再改為文火煎煮，得到相當(dāng)于所述雷公藤質(zhì)量2～4倍的藥引液。
優(yōu)選的，所述武火的溫度大于180℃，所述文火的溫度為80～120℃。
優(yōu)選的，所述浸泡的時(shí)間為2～3小時(shí)，所述文火煎煮的時(shí)間為2～3小時(shí)。
對雷公藤和陳皮采用水提的方法進(jìn)行提取，作為藥引液，可以有效減弱雷公藤的毒性。
優(yōu)選的，還包括飲用白酒，所述飲用白酒與所述藥引液的體積比為(0.8～1.0)：1。
優(yōu)選的，所述飲用白酒的度數(shù)為40～50度。
在中藥制劑中加入飲用白酒，制備成藥酒，可以對中藥中的有效成分進(jìn)行萃取，對中藥中的有效成分進(jìn)行更好的吸收。
如上所述的雷公藤作藥引的中藥制劑的制備方法，包括以下步驟：
將復(fù)方中藥制劑加入藥引液中，加熱使之溶化，降溫后，加入飲用白酒，混勻后得到該雷公藤作藥引的中藥酒劑；
更優(yōu)選的，所述復(fù)方中藥制劑選用免煎中藥。
如上所述的雷公藤作藥引的中藥制劑在制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的藥物中的應(yīng)用，尤其是中醫(yī)辨證為風(fēng)寒濕痹的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
(1)本申請所提供的雷公藤作藥引的中藥制劑，采用陳皮和雷公藤制備的提取液作為藥引，有效降低雷公藤的毒性，配合散寒祛濕的中藥，可以有效治療風(fēng)濕，并且中藥制劑中還含有健脾開胃、利尿的成分，與治療風(fēng)濕的中藥在份數(shù)上合理搭配，有效降低雷公藤的毒性和緩解對患者腹部造成的不適，起到增效減毒的作用。
(2)本申請所提供的雷公藤作藥引的中藥制劑的制備方法，具有方便、簡單、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，適合批量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例，僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供的雷公藤作藥引的中藥制劑，包括由300g雷公藤和100g陳皮制備的藥引液，和如下中藥組份：羌活30g，獨(dú)活90g，海風(fēng)藤50g，秦艽40g，桂枝70g，當(dāng)歸50g，川芎40g，乳香10g，木香10g，甘草50g，防風(fēng)50g，白芷50g，淡附片50g，制川烏50g，細(xì)辛20g，防己50g，萆薢40g，薏苡仁90g，黃芪90g，炒白芍50g，桑寄生20g，牛膝20g，蜈蚣10g，烏梢蛇3g和地龍10g。
其制備方法，包括以下步驟：
(1)、將雷公藤和陳皮加入3000ml的水中浸泡2小時(shí)，先用武火加熱至沸騰，再改為文火煎煮2小時(shí)，得到800ml藥引液；
(2)、將上述免煎的復(fù)方中藥制劑加入步驟(1)中的藥引液中，加熱使中藥融化，降至室溫后加入40度飲用白酒800ml，混勻后得到該雷公藤作藥引的中藥酒劑。
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供的雷公藤作藥引的中藥制劑，包括由400g雷公藤和200g陳皮制備的藥引液，和如下中藥組份：羌活50g，獨(dú)活110g，海風(fēng)藤70g，秦艽60g，桂枝90g，當(dāng)歸70g，川芎60g，乳香30g，木香30g，甘草70g，防風(fēng)70g，白芷70g，淡附片70g，制川烏70g，細(xì)辛40g，防己70g，萆薢60g，薏苡仁110g，黃芪110g，炒白芍70g，桑寄生40g，牛膝40g，蜈蚣15g，烏梢蛇6g和地龍30g。
其制備方法，包括以下步驟：
(1)、將雷公藤和陳皮加入3500ml的水中浸泡2小時(shí)，先用武火加熱至沸騰，再改為文火煎煮2小時(shí)，得到1200ml藥引液；
(2)、將上述免煎的復(fù)方中藥制劑加入步驟(1)中的藥引液中，加熱使中藥融化，降至室溫后加入50度飲用白酒1000ml，混勻后得到該雷公藤作藥引的中藥酒劑。
實(shí)施例3
本實(shí)施例提供的雷公藤作藥引的中藥制劑，包括由320g雷公藤和150g陳皮制備的藥引液，和如下中藥組份：羌活35g，獨(dú)活95g，海風(fēng)藤55g，秦艽45g，桂枝75g，當(dāng)歸55g，川芎45g，乳香15g，木香15g，甘草55g，防風(fēng)55g，白芷55g，淡附片55g，制川烏55g，細(xì)辛25g，防己55g，萆薢45g，薏苡仁95g，黃芪95g，炒白芍55g，桑寄生25g，牛膝25g，蜈蚣12g，烏梢蛇2g和地龍15g。
其制備方法，包括以下步驟：
(1)、將雷公藤和陳皮加入3000ml的水中浸泡3小時(shí)，先用武火加熱至沸騰，再改為文火煎煮3小時(shí)，得到1000ml藥引液；
(2)、將上述免煎的復(fù)方中藥制劑加入步驟(1)中的藥引液中，加熱使中藥融化，降至室溫后加入50度飲用白酒800ml，混勻后得到該雷公藤作藥引的中藥酒劑。
實(shí)施例4
本實(shí)施例提供的雷公藤作藥引的中藥制劑，包括由380g雷公藤和200g陳皮制備的藥引液，和如下中藥組份：羌活45g，獨(dú)活105g，海風(fēng)藤65g，秦艽55g，桂枝85g，當(dāng)歸65g，川芎55g，乳香25g，木香25g，甘草65g，防風(fēng)65g，白芷65g，淡附片65g，制川烏65g，細(xì)辛35g，防己65g，萆薢55g，薏苡仁105g，黃芪105g，炒白芍65g，桑寄生35g，牛膝35g，蜈蚣14g，烏梢蛇5g和地龍25g。
其制備方法，包括以下步驟：
(1)、將雷公藤和陳皮加入4000ml的水中浸泡3小時(shí)，先用武火加熱至沸騰，再改為文火煎煮2小時(shí)，得到1100ml藥引液；
(2)、將上述免煎的復(fù)方中藥制劑加入步驟(1)中的藥引液中，加熱使中藥融化，降至室溫后加入50度飲用白酒1000ml，混勻后得到該雷公藤作藥引的中藥酒劑。
實(shí)施例5
本實(shí)施例提供的雷公藤作藥引的中藥制劑，包括由350g雷公藤和150g陳皮制備的藥引液，和如下中藥組份：羌活40g，獨(dú)活100g，海風(fēng)藤60g，秦艽50g，桂枝80g，當(dāng)歸60g，川芎50g，乳香20g，木香20g，甘草60g，防風(fēng)60g，白芷60g，淡附片60g，制川烏60g，細(xì)辛30g，防己60g，萆薢50g，薏苡仁100g，黃芪100g，炒白芍60g，桑寄生30g，牛膝30g，蜈蚣13g，烏梢蛇3g和地龍20g。
其制備方法，包括以下步驟：
(1)、將雷公藤和陳皮加入4000ml的水中浸泡2～3小時(shí)，先用武火加熱至沸騰，再改為文火煎煮2～3小時(shí)，得到1000ml藥引液；
(2)、將上述免煎的復(fù)方中藥制劑加入步驟(1)中的藥引液中，加熱使中藥融化，降至室溫后加入50度飲用白酒1000ml，混勻后得到該雷公藤作藥引的中藥酒劑。
對比例1
對比例1為實(shí)施例5步驟(1)中所提供的藥引液。
對比例2
對比例2與實(shí)施例5基本相同，只是在煎煮藥引液時(shí)，只加入350g雷公藤而不加入陳皮。
對比例3
對比例3與實(shí)施例5基本相同，只是復(fù)方中藥制劑中，去除開胃健脾的中藥：當(dāng)歸、甘草、薏苡仁、乳香、木香、白芷、黃芪和炒白芍。
對比例4
對比例4與實(shí)施例5基本相同，只是復(fù)方中藥制劑中，去除祛風(fēng)散寒的中藥：羌活、秦艽、白芷、淡附片和桂枝。
實(shí)驗(yàn)例1雷公藤作藥引的中藥制劑對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的影響
(一)實(shí)驗(yàn)對象
Wistar大白鼠，體重(180±20)g，湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號SCXK(鄂)200320005。
(二)實(shí)驗(yàn)藥物
本申請所實(shí)施例1-5所提供的雷公藤作藥引的中藥制劑，以及對比例1-4所提供的中藥。
(三)實(shí)驗(yàn)方法
大鼠CIA模型的建立，將酸性CⅡ溶解于0.1mol/L乙酸(含量2mg/mL)，實(shí)驗(yàn)前將CⅡ溶解加至冷的不完全弗氏佐劑中(1mg/mL)，于每只大鼠左后足跖皮內(nèi)注射0.25mL致炎。
取Wistar大鼠110只，雌雄各半，隨機(jī)分為11組，即正常對照組、模型對照組，實(shí)施例1-5給藥組和對比例1-4給藥組(劑量1mg/kg)。正常對照組注射等量生理鹽水作致炎物質(zhì)。致炎當(dāng)日給藥，連續(xù)28d。分別于致炎前，致炎后第14、16、18、20、24、28天用毛細(xì)管放大測量法測右后足體積，以致炎前體積為基礎(chǔ)值，求出腫脹增長百分率[(給藥后值-給藥前值)/給藥前值]×100。
大鼠致炎后第28天處死，無菌常規(guī)制備脾淋巴細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染液進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)算大于95，調(diào)整細(xì)胞濃度至終濃度為1×106/mL，用含體積分?jǐn)?shù)為10的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，按每孔100μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，給予100μLConA(5μg/mL)或LPS(5μg/mL)分別刺激T、B淋巴細(xì)胞，另設(shè)不給予ConA和LPS刺激的自身空白對照孔，每個(gè)樣品每實(shí)驗(yàn)點(diǎn)設(shè)3復(fù)孔。37℃、5CO2培養(yǎng)44h；每孔加入20μLMIT(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)至48h，終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入200μLDMSO終止反應(yīng)，振蕩搖勻。酶標(biāo)儀檢測(570/630nm)A值。
大鼠處死后，迅速在右足踝關(guān)節(jié)上方0.5cm處摘取腫脹足爪?？v向切開，放入5mL冷生理鹽水中，于4℃浸泡過夜，離心取上清，過濾除菌，-20℃，保存待測NO、PGE2的含量。
取足下跖部位的組織，用10％中性緩沖福爾馬林及時(shí)固定，石蠟包埋，切片，貼片(載玻片預(yù)先用多聚賴氨酸浸泡，撈片后60℃加熱60min，以使切片緊密貼附)，常規(guī)脫蠟至水，0.1mol/LPBS(pH＝7.4)浸泡5min。微波修復(fù)抗原，然后滴加封閉液，甩去多余液體。滴加50稀釋的NF-кβ/p65羊IgG單克隆抗體和MMP-9小鼠IgG單克隆抗體，陰性對照以PBS代替一抗，于4℃孵育過夜。0.1mol/LPBS洗滌3次，每次5分鐘。
結(jié)果判斷：以胞漿出現(xiàn)淡黃色細(xì)顆粒狀著色為陽性細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下觀察，每組隨機(jī)計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性表達(dá)率，同時(shí)觀察染色強(qiáng)度，按染色強(qiáng)度著色淡黃為弱陽性(+)，棕黃為陽性(++)，棕褐色為強(qiáng)陽性(+++)，無著色為陰性(-)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，用t-test進(jìn)行組間顯著性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析采用spss10.0軟件。
藥物對CⅡ誘導(dǎo)大鼠足腫脹的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。對CIA大鼠脾T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。對CIA大鼠脾細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6含量的影響如表3所示。對CIA大鼠關(guān)節(jié)浸液內(nèi)NO、PGE2含量的影響如表4所示。對CIA大鼠組爪組織中NF-кβ/p65蛋白陽性表達(dá)率和MMP-9蛋白陽性表達(dá)率的影響如表5所示。
表1對CⅡ誘導(dǎo)大鼠足腫脹的抑制作用(x±s,n＝10)
與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01；與正常組比較△△P<0.01(表2、3、4同)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠于致炎后14d左右出現(xiàn)繼發(fā)足腫脹，致炎20d左右腫脹度達(dá)峰值。與模型組比較，本申請所供的雷公藤作藥引的中藥制劑表現(xiàn)出抑制足腫脹的作用，表明該中藥制劑能顯著抑制CIA大鼠的繼發(fā)病變。并且，實(shí)施例組的效果優(yōu)于對比例組。
表2對CIA大鼠脾T、B淋巴細(xì)胞增殖活性的影響(x±s,n＝10)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組相比，模型組大鼠ConA、LPS誘導(dǎo)的脾T、B淋巴細(xì)胞增殖活性明顯升高(P<0.01)；與模型組比較本申請所供的雷公藤作藥引的中藥制劑抑制CIA大鼠ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的增殖活性(P<0.01)，和對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖活性(P<0.01)。并且，實(shí)施例組的效果優(yōu)于對比例組。
表3對CIA大鼠脾細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6含量的影響
模型組大鼠脾細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6含量均比正常組顯著升高(P<0.01)，本申請所供的雷公藤作藥引的中藥制劑組和對比例組各項(xiàng)指標(biāo)較模型組均顯著下降(P<0.05,P<0.01)，提示該中藥制劑能顯著抑制CIA大鼠脾細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的水平。并且，實(shí)施例組的效果優(yōu)于對比例組。
表4對CIA大鼠關(guān)節(jié)浸液內(nèi)NO、PGE2含量的影響
模型組大鼠關(guān)節(jié)浸液中NO、PGE2含量與正常組相比明顯增高(P<0.01)，本申請所供的雷公藤作藥引的中藥制劑組關(guān)節(jié)浸液內(nèi)NO、PGE2含量顯著低于模型組(P<0.01)。表明該中藥制劑顯著抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)浸液內(nèi)NO、PGE2的水平。并且，實(shí)施例組的效果優(yōu)于對比例組。
表5對CIA大鼠組爪組織中NF-кβ/p65蛋白陽性表達(dá)率和MMP-9蛋白陽性表達(dá)率的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本申請所供的雷公藤作藥引的中藥制劑組可以明顯降低NF-кβ/p65蛋白和MMP-9蛋白陽性表達(dá)率(P<0.01)。表明該中藥制劑顯著降低兩種蛋白的陽性表達(dá)率。并且，實(shí)施例組的效果優(yōu)于對比例組。
綜上，本申請所提供的雷公藤作藥引的中藥制劑，能對關(guān)節(jié)炎有顯著療效。通過對比例和實(shí)驗(yàn)例組的對比，對比例1為不添加任何中藥的單純的雷公藤提取液，毒性大，效果差。而對比例2可以證明，陳皮的添加可以有效抑制雷公藤的毒性，提高藥效。對比例3和對比例4分別證明了，所添加的健脾開胃和溫?zé)嵘⒑闹兴幘鶎λ幮в写龠M(jìn)作用，并且添加的健脾開胃的中藥可以有效抑制雷公藤的毒性。
實(shí)驗(yàn)例2雷公藤作藥引的中藥制劑不良反應(yīng)測試
(一)實(shí)驗(yàn)動物
SPF級KM小鼠，雌雄各半，體重18～22g，適齡，健康。購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：SCXK(魯)20090001。實(shí)驗(yàn)動物配合飼料(鼠)，生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)20090014。
(二)實(shí)驗(yàn)方法
取小鼠90只，雌雄各半，禁食不禁水12h，以濃度為1mg/kg將實(shí)施例1-5所提供的雷公藤作藥引的中藥制劑和對比例1-4所提供的中藥進(jìn)行連續(xù)灌胃3次，每八小時(shí)一次。每次都要觀察記錄藥后15min，30min，1h，2h，4h，8h的毒性反應(yīng)和死亡情況。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。
表6不良反應(yīng)記錄結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用對比例1所提供的藥物喂藥后，小鼠死亡率高，首先發(fā)生時(shí)的時(shí)間幾種在藥后24-72h間，而對比例2-4比對比例1的死亡率有所降低，但是缺少恰當(dāng)?shù)闹兴幣浔?，影響了對雷公藤水提液的毒性緩釋作用，造成小鼠不良反?yīng)率和死亡率高。
實(shí)驗(yàn)例3雷公藤作藥引的中藥制劑對雄性小鼠生殖細(xì)胞毒性研究
(一)實(shí)驗(yàn)動物及染毒
健康昆明種雄性小鼠66只，體重30～35g，隨機(jī)分為11組，將本申請實(shí)施例1-5所提供的雷公藤作藥引的中藥制劑以及對比例所提供的中藥制劑(劑量1mg/kg)。陰性對照組，灌服1mg/kg的生理鹽水，每日灌服，持續(xù)三周，每周按體重調(diào)整一次劑量。停藥后24h處死。陽性對照組，腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg，注射2d，第3d處死。
(二)實(shí)驗(yàn)方法
(1)骨髓微核實(shí)驗(yàn)
頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取后肢股骨，小牛血清清洗骨髓腔，推片。甲醇固定15min，Giensa染色10～15min，風(fēng)干。油鏡下每只小鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞中含微核的嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算微核千分率。
(2)精子畸形實(shí)驗(yàn)
觀察每只動物的300個(gè)精子，記錄畸變發(fā)生率。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示。
表7骨髓微核實(shí)驗(yàn)和精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微核率可以反應(yīng)致畸因素對細(xì)胞損傷程度和染色體的穩(wěn)定性。采用本申請實(shí)施例和對比例所提供的中藥制劑，對細(xì)胞有不同程度的誘變效應(yīng)。采用對比例1所提供的藥物喂藥后，小鼠細(xì)胞微核率高，而對比例2-4比對比例1的微核率有所降低，但是缺少恰當(dāng)?shù)闹兴幣浔?，影響了對雷公藤水提液的毒性緩釋作用，造成小鼠?xì)胞微核率和精子畸形率高。其中，對比例1為不添加任何中藥的單純的雷公藤提取液，毒性大，效果差。而對比例2可以證明，陳皮的添加可以有效抑制雷公藤的毒性，提高藥效。對比例3和對比例4分別證明了，所添加的健脾開胃和溫?zé)嵘⒑闹兴幘鶎λ幮в写龠M(jìn)作用，并且添加的健脾開胃的中藥可以有效抑制雷公藤的毒性。
盡管已用具體實(shí)施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識到，以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍；因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些替換和修改。