本發(fā)明屬納米材料技術(shù)和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種自組裝的納米氧化鋅載藥膠囊及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥已經(jīng)成為21世紀(jì)多發(fā)病和常見病，找到癌癥的治療方法是人類近些年來的共同目標(biāo)。近年來，納米材料由于其面向固體腫瘤的好的滲透性和在腫瘤處良好的留存性，被賦予了很多關(guān)注。盡管以納米材料為平臺的載藥系統(tǒng)受到了廣泛的關(guān)注，但是其實(shí)際應(yīng)用遇到四個方面的阻礙。第一，大多數(shù)納米材料難以生物降解，甚至對于生物體系具有很大的毒性；第二，載藥釋放系統(tǒng)需要在水中高度分散并且長期保持穩(wěn)定，而大多數(shù)納米材料會在短期內(nèi)團(tuán)聚甚至沉淀；第三，載體越穩(wěn)定就越難分解，而藥物釋放率高則要求載體快速完全分解，兩者之間的平衡不容易把握；第四，關(guān)于藥物載體響應(yīng)的機(jī)制，依賴于光照、磁場、超聲等條件響應(yīng)分解的結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，需要復(fù)雜的合成過程，最終導(dǎo)致藥物載體納米粒子的組成結(jié)構(gòu)不均一，而且很難被生物完全降解。

氧化鋅作為一種安全無毒的材料，是美國食品和藥物管理局（foodanddrugadministration）認(rèn)證的安全物質(zhì)（fda代碼21cfr182.8991），已經(jīng)在化妝品、皮膚藥膏、食品包裝等領(lǐng)域生產(chǎn)應(yīng)用。粒徑1~5納米的氧化鋅量子點(diǎn)具有豐富的表面缺陷，很容易被水分子破壞，因此通過表面修飾的方法制備水溶性的氧化鋅量子點(diǎn)是把它應(yīng)用到生物醫(yī)藥領(lǐng)域的關(guān)鍵。氧化鋅量子點(diǎn)對ph敏感的性質(zhì)特別適合于細(xì)胞內(nèi)液呈弱酸性的癌細(xì)胞，氧化鋅量子點(diǎn)在癌細(xì)胞內(nèi)可以很快溶解而在正常細(xì)胞內(nèi)保持穩(wěn)定，用來負(fù)載抗癌藥物分子就能夠區(qū)分癌細(xì)胞和正常細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)靶向給藥。經(jīng)過精巧的設(shè)計，由氧化鋅量子點(diǎn)構(gòu)建的ph響應(yīng)藥物運(yùn)載與控制釋放系統(tǒng)能夠完美的解決上述納米載藥體常見的四個問題。

很多抗癌藥物自身的疏水性限制了其應(yīng)用，異維a酸就是其中之一。異維a酸是傳統(tǒng)的抗皮膚癌藥物，但是其疏水性阻礙了它的實(shí)際應(yīng)用。以前的研究人員曾經(jīng)采用脂質(zhì)體來包裹和運(yùn)載異維a酸，然而脂質(zhì)體的特性使其藥物負(fù)載率和釋放率都很低。本發(fā)明通過構(gòu)筑氧化鋅納米載藥平臺，不僅成功解決水溶性問題，而且異維a酸負(fù)載率達(dá)到34.6%。此載藥體系在生理?xiàng)l件中保持穩(wěn)定，接觸到腫瘤或者炎癥組織的酸性環(huán)境就會分解，完全釋放出包裹的藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種由氧化鋅納米粒子自組裝形成的載藥膠囊及其制備方法和在癌癥治療方面的應(yīng)用。

本發(fā)明提出的自組裝的納米氧化鋅載藥物膠囊，由氧化鋅納米晶內(nèi)核、聚合物外殼、藥物分子三個部分構(gòu)成。

本發(fā)明提供的納米氧化鋅載藥物膠囊的制備方法，具體步驟為：

（1）合成“氧化鋅-高分子”復(fù)合納米粒子，將有機(jī)鋅鹽放在乙醇中水解生成氧化鋅納米粒子，鋅鹽的濃度是0.09m-0.11m。此過程中，利用自由基引發(fā)氧化鋅納米粒子表面功能團(tuán)與溶劑中的高分子單體共聚，在65℃-75℃經(jīng)過兩步聚合反應(yīng)形成“疏水-親水”共聚物殼層。其中，第一步是具有不飽和雙鍵的功能團(tuán)與溶劑中的高分子單體共聚，第二步是共聚的高分子交聯(lián)到zno納米粒子表面。然后，通過透析除去雜質(zhì)和溶劑，獲得“氧化鋅-高分子”復(fù)合納米粒子；該納米粒子溶于水溶液、ph7緩沖溶液或細(xì)胞培養(yǎng)液中，得到“氧化鋅-高分子”復(fù)合納米粒子溶液；能長期保持穩(wěn)定；

（2）將上述“氧化鋅-高分子”復(fù)合納米粒子溶液與疏水藥物溶液混合，利用藥物分子與納米粒子之間的相互作用，自組裝形成“氧化鋅-藥物”復(fù)合納米膠囊；經(jīng)過反復(fù)透析和濃縮凍干，最終獲得粉末狀產(chǎn)物。

其中，氧化鋅-高分子”復(fù)合納米粒子和疏水藥物的質(zhì)量比通常為1：（0.1-0.5），

所述疏水藥物的溶液，一般為異維a酸的二甲亞砜溶液（異維a酸本身不溶于水，而二甲亞砜可以和水混溶），還可以為地塞米松的二甲亞砜溶液等。

本發(fā)明制備得到的“氧化鋅-藥物”復(fù)合納米膠囊，直徑為50~150納米（根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件可調(diào)節(jié)），藥物負(fù)載量超過30%（總質(zhì)量比），在室溫下水溶液中保持穩(wěn)定超過1年。

本發(fā)明制備得到的“氧化鋅-藥物”復(fù)合納米膠囊，具有高負(fù)載率（異維a酸負(fù)載率達(dá)到34.6%）、水溶性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、對ph值敏感等優(yōu)點(diǎn)，能夠大量負(fù)載疏水性藥物，同時根據(jù)ph響應(yīng)完全釋放藥物，可以用于高效殺死癌細(xì)胞。

所以本發(fā)明的“氧化鋅-藥物”復(fù)合納米膠囊可以用于制備癌癥治療藥物。

本發(fā)明提出的“氧化鋅-藥物”復(fù)合納米膠囊，可以對各種癌細(xì)胞進(jìn)行體外殺傷，其抗癌毒性比疏水的藥物本身普遍提高2-3倍。例如，負(fù)載了異維a酸后，對肺癌細(xì)胞a549的毒性甚至超過了已經(jīng)市場化的抗肺癌藥物尼達(dá)尼布和克唑替尼。

所述的“氧化鋅-藥物”復(fù)合納米膠囊，具有ph響應(yīng)的功能，將其溶解到不同ph值的緩沖溶液中，可利用氧化鋅納米粒子在弱酸性條件下分解的特征釋放藥物。當(dāng)ph值在7.0以上，該納米粒子非常穩(wěn)定；當(dāng)ph值在6.0~7.0范圍，氧化鋅納米粒子緩慢分解；當(dāng)ph在5.0~6.0范圍，氧化鋅納米粒子在24小時內(nèi)就能完全分解釋放藥物，藥物釋放率超過95%。由于癌細(xì)胞中，ph值通常在6.0以下，而正常細(xì)胞的ph值在7.4左右，因此這種“氧化鋅-藥物”復(fù)合納米膠囊能夠選擇性殺死癌細(xì)胞。

本發(fā)明的原理是，先通過溶膠凝膠法和兩步共聚反應(yīng)在氧化鋅納米粒子表面包覆共聚高分子，該高分子由疏水基團(tuán)和親水鏈段構(gòu)建，具有表面活性劑的特征。這種設(shè)計一方面保護(hù)了氧化鋅內(nèi)核不被水溶液破壞，同時具有良好的水溶性；另一方面“氧化鋅-高分子”納米粒子能夠包覆到疏水的藥物分子聚集體上，形成自組裝的膠囊型納米球載藥平臺。該載藥平臺在ph7以上結(jié)構(gòu)長期保持穩(wěn)定，但是在ph6以下氧化鋅完全分解同時導(dǎo)致整個膠囊分解釋放藥物，實(shí)現(xiàn)了在腫瘤弱酸性環(huán)境下靶向給藥的目標(biāo)。雖然氧化鋅和高分子本身幾乎無毒，但是癌細(xì)胞毒性測試證明用該載藥平臺釋放藥物的毒性顯著超過藥物本身，甚至超過某些市場化的同類抗癌藥物。

附圖說明

圖1是實(shí)施例5產(chǎn)品的高分辨透射電子顯微鏡照片。其中，a為“氧化鋅-高分子”納米粒子的透射電鏡照片，b為“氧化鋅-高分子”納米粒子的高分辨透射電鏡照片，c為負(fù)載了異維a酸的納米膠囊的透射電鏡照片，d為負(fù)載了異維a酸的納米膠囊的場發(fā)射掃描電鏡照片，其中插圖是其高分辨照片。從a和b圖可以看出實(shí)施例5的產(chǎn)品其氧化鋅納米粒子的直徑為3納米，晶格間距為0.25nm；從c和d圖可以看出合成的納米膠囊為100nm，為氧化鋅包裹的異維a酸的核殼結(jié)構(gòu)。

圖2是氧化鋅與異維a酸在合成過程中的配比從1:0.1變化到1:0.5時，所得到的納米膠囊平均直徑從70納米變化到110納米。隨著氧化鋅與異維a酸質(zhì)量比的增加，合成的微乳球的直徑也逐步增加。

圖3是氧化鋅藥物復(fù)合物載體平臺對于癌細(xì)胞的治療效果的比較。圖中abcd為氧化鋅、異維a酸和氧化鋅-異維a酸復(fù)合納米載體分別對于前列腺癌細(xì)胞du145、宮頸癌細(xì)胞hela、乳腺癌細(xì)胞mcf-7和肺癌細(xì)胞a549四種癌細(xì)胞的mtt細(xì)胞毒性測試對比圖?？梢钥闯鰪?fù)合后的氧化鋅異維a酸復(fù)合物的毒性遠(yuǎn)大于氧化鋅和異維a酸單體，證明了復(fù)合物的毒性增強(qiáng)。其中對于肺癌細(xì)胞a549，其毒性的提升最明顯，所以我們將之與已經(jīng)上市的抗肺癌藥物尼達(dá)尼布和克唑替尼進(jìn)行了對比試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，純的異維a酸比起上市藥物并不優(yōu)越，但是對于復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)其對于a549的殺死作用遠(yuǎn)大于克唑替尼和尼達(dá)尼布，改良的藥物載體平臺大大增強(qiáng)了異維a酸的抗癌效果。

圖4為“氧化鋅-高分子”納米粒子在水中自組裝形成納米膠囊，負(fù)載藥物后在癌細(xì)胞弱酸性條件下分解釋放藥物的過程。

圖5是將氧化鋅異維a酸藥物載體系統(tǒng)于不同癌細(xì)胞分別作用12小時，24小時和48小時之后得到的細(xì)胞存活率對比圖。從結(jié)果來看，作用時間超過24小時后，數(shù)據(jù)幾乎無改變，表明24小時是藥物作用于癌細(xì)胞的最佳時間。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

（1）氧化鋅量子點(diǎn)的合成

稱取0.47克的甲基丙烯酸鋅粉末置于三口燒瓶中，加入25毫升的無水乙醇，加熱至72℃至其完全溶解。待其冷卻至室溫后，加入0.06克的偶氮異丁腈（aibn）和3.75毫升的聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯（pegmema），在磁力攪拌的作用下加熱至72℃；10min后，加入25毫升的氫氧化鋰溶液（0.14摩爾/升）和0.06克的偶氮異丁腈（aibn）。于72℃下磁力攪拌1小時。待其冷卻至室溫后，放入透析袋中，于去離子水中透析3天，得到聚合物修飾的氧化鋅納米材料；

（2）氧化鋅-異維a酸納米粒子的合成

取20毫升的氧化鋅（1毫克/毫升）納米粒子的水溶液，加入0.025克的異維a酸溶于25毫升的二甲亞砜溶液2毫升，在黑暗中攪拌，之后用去離子水透析三天除去未反應(yīng)的藥物和二甲亞砜溶液；

（3）將復(fù)合藥物中藥物濃度配制為為10微克/毫升，作用于肺癌細(xì)胞a54924h，之后測細(xì)胞存活率。主要是應(yīng)用酶標(biāo)儀來檢測細(xì)胞的存活率。通過酶標(biāo)儀的檢測可以得出細(xì)胞的生存狀態(tài)。主要的原理是酶聯(lián)免疫吸附劑測定原理，抗原或抗體結(jié)合到一些固相載體表面，同時保持其免疫活性，此時抗原或抗體與特定的酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，能保留載體的免疫活性，也能保留酶的活性。洗滌把固相載體上的抗原抗體復(fù)合物和其他物質(zhì)分開，載體上的酶含量和標(biāo)本中受檢物質(zhì)含量形成特定的比例。將酶反應(yīng)的底物加入后，底物被酶催化成有色的產(chǎn)物，產(chǎn)物的含量和標(biāo)本中受檢物質(zhì)的含量相關(guān)，因此可根據(jù)顏色的深淺進(jìn)行定性或者定量分析。鑒于酶的催化頻率高，極大地放大了反應(yīng)結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。存活率=（測定樣品吸光度-空白樣品吸光度）/（對照細(xì)胞吸光度-空白細(xì)胞吸光度）。

實(shí)施例2

制備方法和實(shí)施例1相同，但是步驟（2）中使用的異維a酸（1毫克/毫升）為4毫升，其他條件不變。研究不同的投料比對于納米藥物系統(tǒng)負(fù)載率的影響，以及mtt測試得到的細(xì)胞存活率。

實(shí)施例3

制備方法和實(shí)施例1相同，但是步驟（2）中使用的異維a酸（1毫克/毫升）為6毫升，其他條件不變。研究不同的投料比對于納米藥物系統(tǒng)負(fù)載率的影響，以及mtt測試得到的細(xì)胞存活率。

實(shí)施例4

制備方法和實(shí)施例1相同，但是步驟（2）中使用的異維a酸（1毫克/毫升）為10毫升，其他條件不變。研究不同的投料比對于納米藥物系統(tǒng)負(fù)載率的影響，以及mtt測試得到的細(xì)胞存活率。

實(shí)施例5

制備方法和實(shí)施例1相同，但是步驟（3）中使用的細(xì)胞換成前列腺癌細(xì)胞du145其他條件不變。研究納米藥物載體對于不同的癌細(xì)胞的作用，以及mtt測試得到的細(xì)胞存活率。

實(shí)施例6

制備方法和實(shí)施例1相同，但是步驟（3）中使用的細(xì)胞換為宮頸癌細(xì)胞hela其他條件不變。研究納米藥物載體對于不同的癌細(xì)胞的作用，以及mtt測試得到的細(xì)胞存活率。

實(shí)施例7

制備方法和實(shí)施例1相同，但是步驟（3）中使用的細(xì)胞換為乳腺癌細(xì)胞mcf-7，其他條件不變。研究納米藥物載體對于不同的癌細(xì)胞的作用，以及mtt測試得到的細(xì)胞存活率。

實(shí)施例8

制備方法和實(shí)施例1相同，但是步驟（3）中使用的細(xì)胞換為乳人結(jié)直腸腺上皮細(xì)胞dld-1，其他條件不變。研究納米藥物載體對于不同的癌細(xì)胞的作用，以及mtt測試得到的細(xì)胞存活率。

實(shí)施例9

制備方法和實(shí)施例1相同，但是步驟（3）中使用的細(xì)胞換為肝癌細(xì)胞hepg-2，其他條件不變。研究納米藥物載體對于不同的癌細(xì)胞的作用，以及mtt測試得到的細(xì)胞存活率。

實(shí)施例10

制備方法和實(shí)施例1相同，但是步驟（1）中使用的異維a酸換為維a酸，其他條件不變。研究不同疏水性藥物的負(fù)載性質(zhì)，以及mtt測試得到的細(xì)胞存活率。

實(shí)施例11

制備方法和實(shí)施例5相同，但是步驟（2）中將異維a酸替換成視黃醇，其他條件不變。研究不同疏水性藥物的負(fù)載性質(zhì)，以及mtt測試得到的細(xì)胞存活率。

實(shí)施例12

制備方法和實(shí)施例5相同，但是步驟（2）中將異維a酸替換成阿利維a酸，其他條件不變。研究不同疏水性藥物的負(fù)載性質(zhì)，以及mtt測試得到的細(xì)胞存活率。

本發(fā)明將不同的疏水性藥物異維a酸、維甲酸、視黃醇、阿利維a酸與氧化鋅納米材料的復(fù)合，并對于異維a酸的不同比例進(jìn)行探索，“氧化鋅-高分子”納米粒子與異維a酸的質(zhì)量比為1：0.5左右時為最佳，并將之應(yīng)用于肺癌細(xì)胞a549、前列腺癌細(xì)胞du145、宮頸癌細(xì)胞hela、乳腺癌細(xì)胞mcf-7的癌細(xì)胞、人結(jié)直腸腺上皮細(xì)胞dld-1、肝癌細(xì)胞hepg2的檢測之中。見下表3所示。

表3

。