本發(fā)明涉及一種活性多肽在制備離子通道工具試劑中的用途，尤其是用化學法制備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xi（簡寫為spkp-xi）在制備電壓門控鈉通道工具試劑-心肌鈉通道抑制劑中的用途。

背景技術：

電壓門控鈉通道廣泛分布于神經(jīng)元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，其參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過程,同時也是治療藥物作用的重要靶標之一。鈉通道在動作電位的產(chǎn)生和傳播過程中的關鍵性作用，電壓門控鈉通道成為很多動植物毒素的作用靶標。鈉離子通道的結(jié)構(gòu)與功能關系研究已經(jīng)成為國際上的研究熱點。電壓門控鈉通道很可能成為神經(jīng)性和心血管等疾病的重要治療靶點。自然界的動物毒素是一類具有很高實用價值和應用前景的工具試劑或藥物導向物質(zhì)，不僅是有毒動物抵御天敵的有力武器，也是從事神經(jīng)生物學和生理學研究、天然創(chuàng)新藥物開發(fā)以及蛋白質(zhì)基礎研究的寶貴材料,同時也是研究離子通道的獨特“分子探針和解密器”。迄今為止，從多種動物（如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋動物等）的毒液中鑒定到了很多作用于鈉通道的活性成分。它們通過與鈉通道的不同位置相結(jié)合從而引起通道的動力學特征發(fā)生相應的變化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延緩等。通過闡述這些特異性調(diào)制劑作用于鈉通道的分子機制，除了在理論上可深入推測鈉通道亞型之間的功能活動區(qū)別和門控活動機制外，還可以為將它們開發(fā)成治療人類相關疾病的新藥提供充分的理論基礎和廣闊的應用前景。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在于提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xi在制備電壓門控鈉通道工具試劑-心肌鈉通道抑制劑中的應用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xi（簡寫為spkp-xi），其氨基酸序列為：

nh2-glucysarglysmetpheglyglycysservalaspseraspcyscysalahisleuglycyslysprothrleulystyrcysalatrpaspglythrphe-nh2

其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xi作為單一有效活性組份用于制備心肌鈉通道抑制劑。

所述的一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xi在制備電壓門控鈉通道工具試劑-nav1.5型鈉通道抑制劑中的應用，其特征在于，所述的蜘蛛抑鉀肽-xi的n端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，n端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，n端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。

該蜘蛛抑鉀肽-xi作為單一有效活性組分用于制備心肌鈉通道抑制劑，以細胞外給藥的方式制備成心肌鈉通道工具試劑。

蜘蛛抑鉀肽-xi在制備心肌鈉通道工具試劑或抑制劑時，配制細胞外給藥的劑量為5μmol/l。

蜘蛛抑鉀肽-xi抑制心肌鈉通道的半數(shù)有效作用劑量ic50為1.28μmol/l，是一種較好的心肌鈉通道工具試劑。

附圖說明

圖1是空白對照下的心肌鈉通道電流。

圖2是5μmol/lspkp-xi對心肌鈉通道的影響。

圖3是spkp-xi作用于心肌鈉通道的濃度-效應關系曲線。

圖4是spkp-xi對心肌鈉通道電流-電壓關系的影響。

具體實施方式

為了更好的理解和更充分公開本發(fā)明，下面將通過細胞外給藥途徑，采用原代心肌細胞模型來說明蜘蛛抑鉀肽-xi的心肌鈉通道抑制作用。

1、實驗材料和方法

1.1大鼠心肌細胞(cardiacmyocytes)的分離和培養(yǎng)

心肌細胞也是目前常用于電生理領域研究的一種細胞，特別是應用于研究藥物對受損心臟治療效果的機制，如缺血、缺氧等。與drg細胞相比，其上分布的離子通道種類少、簡單。鈉通道主要是ttx-r型（nav1.5）。含有l(wèi)-型高閾值激活和t-型低閾值激活鈣通道，但不含n-型鈣通道。

1.1.1組織溶液

含ca²⁺臺氏液:nacl143mm；kcl5.4mm；mgcl20.5mm；hepes5mm；nah2po40.33mm；glucose10mm；cacl21.8mm；用naoh調(diào)ph=7.4；

無ca²⁺臺氏液:nacl143mm；kcl5.4mm；mgcl20.5mm；hepes5mm；na2hpo40.33mm；glucose10mm；用naoh調(diào)ph=7.4；

kb液(l-glutamicacid70mm；kcl25mm；taurine20mm；kh2po410mm；mgcl23mm；egta0.5mm；glucose10mm；hepes10mm；用koh調(diào)ph=7.3)；

酶解液:30ml無鈣臺氏液中加入膠原酶4.5mg和牛血清白蛋白9mg。

以上溶液均用0.22微米孔徑的濾膜過濾，實驗前于37℃水浴恒溫，充以95%的o2和5%的c02混合氣體10min至飽和。

1.1.2分離程序

首先在直徑10cm培養(yǎng)皿中盛放20ml含ca²⁺臺氏液，并用臺氏液先灌滿langendorff灌流裝置，關閉裝置并向裝置中充氧。在其后的整個灌流過程中不停充氧，且保持心臟內(nèi)部溫度始終在37℃左右。

取體重250g左右大鼠，雌雄不拘，斷頭，打開胸腔，夾住心尖向上提起，剪斷血管，迅速取出心臟，注意保持心臟的完整，免受損傷。將心臟放入盛有臺氏液的培養(yǎng)皿中，冼去一部分凝血，如果心臟上部附有較多的脂肪等組織，可稍修剪。找到主動脈（血管壁粗厚，直立），將主動脈穿入langendorff灌流裝置的下部的針尖上，用棉線固定，用37℃有ca²⁺臺氏液灌流，可以看到心臟復跳，且搏動越來越強，血液不斷流出，心臟壁上的血絲逐漸被洗去，至流出液體無血色，透明，換用無ca²⁺臺氏液沖洗。隨著ca²⁺的稀釋，心臟搏動漸趨微弱，心臟變硬并擴大，灌流至心臟完全停止跳動，用酶解液沖洗（30ml反復利用）6min，心臟顏色逐漸呈半透明，流出液體呈拉絲狀，稍變渾濁。換用kb液沖洗，洗凈心臟中的酶液，至心臟顏色由紅變白，由硬變軟，取下心臟，剪取下部心室部分，剪碎（酶解作用好的心臟內(nèi)部已呈粘稠狀），放入盛有10mlkb液的指管中，于37℃恒溫箱中振蕩5-8min。取細胞懸液于500轉(zhuǎn)/分離心2min，取離心沉淀，用kb液分裝入35mm培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時后細胞貼壁。在顯微鏡下挑選合適細胞進行膜片鉗記錄。

1.2膜片鉗電生理活性實驗

膜片鉗實驗均在室溫（25±1℃）進行，采用全細胞膜片鉗技術。挑選質(zhì)膜光滑可見、胞質(zhì)均勻的細胞作為實驗細胞。電流記錄通過全細胞膜片鉗技術利用epc9放大器(heka公司,german)在電腦上進行。計算機記錄和分析系統(tǒng)采用pulse+pulsefit8.0軟件。玻璃電極管為硼硅酸鹽玻璃毛細管（南京泉水教學實驗器材廠）。玻璃電極兩步拉制而成，經(jīng)拋光儀(narishige,japan)拋光后電極尖端直徑約為3μm，充灌電極液后電極電阻為1-3mω。膜片鉗實驗要在室溫條件下進行，整個實驗過程中溫度的變動最多上下不超過2℃。采用sigmaplot9.0軟件分析實驗結(jié)果。

2、實驗結(jié)果與分析

2.1spkp-xi對大鼠心肌細胞的鈉通道的影響

心肌細胞上所表達的鈉離子通道以ttx-不敏感型，即nav1.5為主，盡管也有報道認為心肌細胞含有其他類型的鈉離子通道，但是其表達量非常低，因此，spkp-xi對心肌細胞的鈉離子通道的影響可以被看作是對nav1.5通道的影響。由圖1和2可見，心肌鈉通道電流在加入5mm的spkp-xi之前和之后有明顯變化，表現(xiàn)為峰值電流減小以及失活變得較為緩慢。

在全細胞記錄電壓鉗模式下，將細胞鉗制在-80mv時，分別給予一組測試電壓，其變化范圍為-80～+50mv，步幅為+10mv，持續(xù)時間為50ms，可在心室肌細胞上得到ttx不敏感型鈉通道的激活電流-電壓（i-v）關系曲線圖（圖4），并能揭示出通道的激活閾值、逆轉(zhuǎn)電位和最大激活峰值電流電壓大小。在空白對照條件下，ttx不敏感型鈉通道的起始激活電壓為-50mv，最大峰值電流激活電壓為-30mv左右，逆轉(zhuǎn)電位為+35mv左右。

2.2spkp-xi對心肌電壓門控鈉通道激活狀態(tài)的影響

由圖4可見，5mmspkp-xi能夠在-60mv到+50mv之間的測試電壓范圍內(nèi)明顯抑制電流的失活相以及峰值電流，并在-20mv左右抑制比例最大；且能使通道始激活電壓和峰值電流激活電壓向去極化方向漂移超過+10mv，但反轉(zhuǎn)電位變化不明顯，說明毒素不影響通道對鈉離子的選擇透過性。同時，spkp-xi對鈉通道的影響具有濃度依賴性(圖3)，其抑制鈉通道電流的ic50值為1.28mm。有意思的是，spkp-xi對心肌鈉通道的失活也有影響，能明顯延緩心肌鈉通道的失活(圖4)。在圖4中，i10ms代表在去極化10ms時測得的電流幅度值，在空白情況下，這一數(shù)值應該為0，表示鈉通道已進入正常的失活相，而在加入5mmspkp-xi的情況下，i10ms在-20mv仍有25±4%不能正常失活。這表明spkp-xi可以延緩心肌鈉通道的失活。

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