本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，具體涉及黃連素或其衍生物在制備心肌灌注顯像劑中的用途。

背景技術(shù)：

冠心病是危害人類生存和健康的主要疾病之一，統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，我國冠心病發(fā)病率和死亡率逐年上升，并向年輕化趨勢發(fā)展，不僅僅是患者的傷痛，還給家庭社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。自20世紀70年代，心肌灌注顯像開始用于無創(chuàng)診斷心臟疾病，目前已成為診斷冠心病、評估冠狀動脈病變程度和范圍、評估療效和判斷預(yù)后的重要影像學(xué)方法，對指導(dǎo)冠心病治療具有重要意義。

心肌灌注顯像分為spect(核醫(yī)學(xué)單光子發(fā)射計算機斷層掃描)和pet(正電子發(fā)射計算機斷層掃描)，與spect相比，pet心肌灌注顯像具有更高的空間分辨率、時間分辨率和更精確的衰減校正技術(shù)優(yōu)勢，具有更高的靈敏度，并且可定量測定冠狀動脈血流灌注量，對診斷cad具有高敏感性、高特異性和高準確率，受到研究者們的廣泛關(guān)注。

目前，fda已批準的pet心肌灌注顯像藥物，包括[¹⁵o]h2o(半衰期:2.06min)、[¹³n]nh3(半衰期:9.96min)和⁸²rb(半衰期:1.25min)，但它們的半衰期都太短＜10min，需要在線回旋加速器生產(chǎn)，并因無法進行運動負荷門控心肌灌注顯像，極大地限制了pet心肌灌注顯像在臨床的廣泛應(yīng)用。¹⁸f的物理半衰期長達109.8min,更適于臨床pet顯像，是臨床最常用核素。¹⁸f具有良好的核物理和化學(xué)性質(zhì)，也是開發(fā)新型pet正電子新藥的首選核素。因此，研制新型的18f標記的心肌灌注顯像劑具有重要的現(xiàn)實意義。

黃連素是一種異喹啉類生物堿，它可從多種中草藥如白毛茛、黃柏、黃連等中分離，黃連素具有廣泛的生物學(xué)作用，如抗菌、消炎、止瀉、止吐及解熱鎮(zhèn)痛等。國內(nèi)外許多藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)黃連素具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抑制內(nèi)皮細胞凋亡及血管平滑肌細胞增殖以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗心力衰竭、抗心律失常以及抗動脈粥樣硬化等功效。目前，未有黃連素或其衍生物用于心肌灌注顯像的研究報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供黃連素或其衍生物在制備心肌灌注顯像劑中的用途。本發(fā)明還提供了黃連素或其衍生物在制備心肌灌注顯像劑中的用途。

本發(fā)明還提供了放射性標記的黃連素或其衍生物在制備心肌灌注顯像劑中的用途。

放射性標記：即放射性核素標記。

其中，所述放射性標記為¹⁸f標記。

其中，所述¹⁸f標記的黃連素衍生物的結(jié)構(gòu)式為：

其中，所述¹⁸f標記的黃連素衍生物的結(jié)構(gòu)式為：

其中，所述心肌灌注顯像劑為正電子心肌灌注顯像劑。

本發(fā)明還提供了黃連素或其衍生物在制備診斷冠心病的試劑中的用途。

本發(fā)明還提供了放射性標記的黃連素或其衍生物在制備診斷冠心病的試劑中的用途，其中，所述放射性標記為¹⁸f標記。

其中，所述¹⁸f標記的黃連素衍生物的結(jié)構(gòu)式為：

其中，所述¹⁸f標記的黃連素衍生物的結(jié)構(gòu)式為：

本研究從體外研究、體內(nèi)生物分布及小動物pet動態(tài)顯像等方面驗證了本發(fā)明18f標記黃連素衍生物可特異性聚集于心肌細胞或心臟組織，在活體動物體內(nèi)具有良好的心肌靶向分布特性，心臟/周圍組織對比(肝、肺、血液、肌肉、骨骼等)值較高，可以作為一種良好的pet心肌灌注顯像劑。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1h9c2細胞攝取[¹⁹f]hx-01熒光圖

圖2sd乳鼠原代心肌細胞攝取[¹⁹f]hx-01圖

圖3sd乳鼠原代心肌細胞攝取[¹⁹f]hx-01及紅色線粒體探針定位

圖4h9c2細胞攝取[¹⁸f]hx-01時間-活度曲線

圖5sd大鼠原代心肌細胞及nih3t3細胞攝取[¹⁸f]hx-01時間-活度曲線

圖6心臟與周圍組織放射性比值隨時間變化趨勢圖

圖7健康昆明小鼠注射[¹⁸f]hx-01后4h內(nèi)各器官時間-活度曲線：每克組織放射性物質(zhì)占注射量的百分比％id/g

圖8正常新西蘭大白兔注射[¹⁸f]hx-01后行micropet動態(tài)顯像

圖9正常新西蘭大白兔耳緣靜脈注射[¹⁸f]hx-01后2h內(nèi)各器官時間-活度曲線：suvmax。

圖10正常新西蘭大白兔耳緣靜脈注射[¹⁸f]hx-01后2h內(nèi)心臟/周圍組織

suvmax比值

圖11心臟攝取[¹⁸f]hx-01對照組及[¹⁹f]hx-01抑制組放射性對比：suvmax

圖12肝臟攝取[¹⁸f]hx-01對照組及[¹⁹f]hx-01抑制組放射性對比：suvmax

圖13肺攝取[¹⁸f]hx-01對照組及[¹⁹f]hx-01抑制組放射性對比：suvmax

圖14腎攝取[¹⁸f]hx-01對照組及[¹⁹f]hx-01抑制組放射性對比：suvmax

具體實施方式

下面以實施例作進一步說明，但本發(fā)明不局限于這些實施例。

實施例1本發(fā)明18f標記黃連素衍生物的制備

本發(fā)明18f標記黃連素衍生物(命名為[¹⁸f]hx-01)由四川大學(xué)華西醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科提供，也可按照公告號為cn102989017b的專利方法合成。

[¹⁹f]hx-01：為18f標記黃連素衍生物非放射性對照品，按照公告號為cn102989017b的專利方法合成。

以下通過試驗例具體說明本發(fā)明的有益效果：

試驗例118f標記黃連素衍生物及其非放射性對照品的細胞攝取實驗

1材料與方法

1.1細胞株及實驗動物

大鼠心肌細胞h9c2及小鼠胚胎成纖維細胞nih3t3為四川大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究中心贈送；sd乳鼠由成都達碩實驗動物公司從北京斯萊克生物有限公司代購。

1.2主要試劑

1.3儀器設(shè)備

1.4方法

1.4.1[¹⁹f]hx-01儲存液的制備

用電子天平秤取粉末狀18f標記黃連素衍生物非放射性對照品[¹⁹f]hx-013.8mg加入預(yù)先配好的50％dmso1ml(3mldmso+3ml三蒸水)，即10mm濃度([¹⁹f]hx-01:381.7g/mol),取其中1ml，加入9mlpbs稀釋10倍，得到濃度為1mm的f-bbr儲存液，于-20℃冰箱冷凍儲存?zhèn)溆谩?.4.2大鼠心肌細胞株h9c2及小鼠胚胎成纖維細胞株nih3t3細胞培養(yǎng)

細胞均用添加10％小牛血清或胎牛血清和1％青鏈霉素雙抗的dmem高糖培養(yǎng)基，在37℃5％co2增濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞融合度達90％左右時用0.25％胰酶消化后以1:2傳代。每日用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長情況，2-3d換一次培養(yǎng)基。h9c2細胞及nih3t3細胞3-4天傳代一次，取處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。細胞傳代超過20次后棄去不用，重新復(fù)蘇細胞。

1.4.3sd乳鼠原代心肌細胞的制備與培養(yǎng)

(1)消化液的配置：稱量胰蛋白酶和ⅱ型膠原酶并將其溶于無鈣鎂離子的pbs中，終濃度為0.05％胰蛋白酶、0.05％ⅱ型膠原酶。用0.22μm的濾器過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

(2)心臟的獲得：取新生1-3天的sd大鼠的乳鼠，經(jīng)過酒精消毒后置于生物安全柜中，沿胸骨中線左側(cè)剪開胸壁，用眼科鑷鉗取心臟心尖部1/2組織置于盛有3mldmem高糖培養(yǎng)基的10ml無菌負壓瓶中。

(3)心臟組織的破碎：用眼科剪將取得的心臟組織剪成大小約1mm的組織塊，用無鈣鎂離子的pbs洗三遍，將組織塊移至50ml離心管中備用。

(4)向離心管加入5-10ml消化液，混勻震蕩，用移液管吸取消化液，棄之不用。然后重新加入5-10ml消化液37℃水浴消化約3-5分鐘至消化液出現(xiàn)渾濁，取上清至含有10ml終止培養(yǎng)基(dmem高糖培養(yǎng)基+10％小牛血清+1％青鏈霉素雙抗)的離心管中。

(5)重復(fù)步驟(4)直至離心管內(nèi)無明顯組織塊，肉眼不可見或留有少量絮狀膠狀沉淀。

(6)將收集有細胞懸液的離心管置于低溫離心機中，1400r，離心5分鐘。

(7)收集上清，用含10％胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)基將細胞重懸，吹打均勻，將收集到的上清液以步驟(6)再次離心，然后將上清棄去，用10％胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)基將所有細胞重懸，吹散。

(8)差速貼壁：將細胞首先接種于培養(yǎng)皿中貼壁30分鐘。由于成纖維細胞的貼壁速率高于心肌細胞，通過差速貼壁可以進一步去除培養(yǎng)體系中的成纖維細胞。

(9)移出培養(yǎng)皿中的細胞懸液將其稀釋至20萬/ml，再接種于六孔板中。

(10)在37℃，5％co2孵箱中培養(yǎng)15小時后，加入0.1mmbrdu

(11)24小時后換液，每日用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，心肌細胞成簇聚集并節(jié)律性搏動，隨后每1-2日更換培養(yǎng)基，備用。

1.4.4[¹⁹f]hx-01在h9c2細胞及sd乳鼠原代心肌細胞的攝取及其定位

h9c2細胞傳至第6代，用0.25％胰酶消化，收集處于對數(shù)生長期的細胞，并調(diào)整細胞懸液的濃度為1×10⁴/ml，接種于六孔板，每孔2ml，37℃5％co2飽和濕度下培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，吸棄孔內(nèi)dmem高糖培養(yǎng)基，加入含不同濃度[¹⁹f]hx-01(6.25、12.5、25、50及100μm)的pbs(含0.5％fbs)，每孔2ml，每個濃度3個復(fù)孔，同時設(shè)細胞對照(含pbs和細胞)和空白對照(僅加pbs，不含細胞)，37℃5％co2飽和濕度作用1h后，吸棄孔內(nèi)液體，pbs沖洗3次后，于488nm激發(fā)波長熒光顯微鏡下觀察細胞。

sd乳鼠原代心肌細胞的提取如1.4.3方法所述。將差速貼壁收集到的sd乳鼠原代心肌細胞懸液調(diào)整到濃度為20×10⁴/ml接種于六孔板中，每孔2ml，37℃5％co2飽和濕度下培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，吸棄孔內(nèi)dmem高糖培養(yǎng)基，加入含不用濃度[¹⁹f]hx-01(6.25、12.5、25、50及100μm)的dmem高糖培養(yǎng)基，每孔2ml，每個濃度3個復(fù)孔，同時設(shè)細胞對照(含dmem高糖培養(yǎng)基和細胞)和空白對照(僅加dmem高糖培養(yǎng)基，不含細胞)，37℃5％co2飽和濕度作用1h后，吸棄孔內(nèi)液體，pbs沖洗3次后，于488nm激發(fā)波長共聚焦熒光顯微鏡下觀察細胞。

sd乳鼠原代心肌細胞懸液調(diào)整濃度為20×10⁴/ml接種于六孔板中，每孔2ml，37℃5％co2飽和濕度下培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，吸棄孔內(nèi)dmem高糖培養(yǎng)基，首先加入含不同濃度[¹⁹f]hx-01(6.25、12.5、25、50、100、150及200μm)的dmem高糖培養(yǎng)基，每孔2ml，每個濃度3個復(fù)孔，37℃5％co2飽和濕度作用1h后，吸棄孔內(nèi)液體，pbs沖洗3次后，隨后加入含有4μm紅色熒光線粒體探針的dmem高糖培養(yǎng)37℃5％co2飽和濕度作用10min后，吸棄孔內(nèi)液體，pbs沖洗3次后，最后于488nm激發(fā)波長共聚焦熒光顯微鏡下觀察細胞。

1.4.5比較大鼠心肌細胞h9c2、sd乳鼠原代心肌細胞及小鼠成纖維細胞nih3t3攝取[¹⁸f]hx-01的特性及cccp能否抑制攝取心肌細胞攝取[¹⁸f]hx-01。

cccp：羰基氰化物間氯苯{2-[2-(3-chlorophenyl)hydrazinylyidene]propanedinitrile，cccp}，為線粒體膜電位抑制劑。

如方法1.4.4所述將大鼠心肌細胞h9c2、nih3t3細胞及sd乳鼠原代心肌細胞懸液的濃度調(diào)整為20×10⁴/ml，接種于六孔板，設(shè)置實驗組及cccp抑制組。每孔2ml(含4×10⁵個細胞)，37℃5％co2飽和濕度下培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后。在加入[¹⁸f]hx-01前30min，吸棄培養(yǎng)皿內(nèi)dmem高糖培養(yǎng)基，首先向cccp抑制組細胞培養(yǎng)皿中加入2ml/孔含有cccp(0.5μm)的dmem高糖培養(yǎng)基，向?qū)嶒灲M細胞培養(yǎng)皿中加入等體積不含cccp的dmem高糖培養(yǎng)基，37℃5％co2飽和濕度下孵育30min。隨后每孔加入100μl溶于生理鹽水的[¹⁸f]hx-01，劑量為2.5μci。于37℃5％co2飽和濕度孵育，分別育5min、10min、30min、60min及120min后，收集孔內(nèi)液體，pbs沖洗3次收集全部沖洗液體于放免管中；用0.25％胰酶消化，收集全部細胞于放免管中，用γ計數(shù)器分別測定孔內(nèi)液體及細胞的放射性計數(shù)，記錄整理數(shù)據(jù)。每個時間點3個復(fù)孔。

2結(jié)果

2.1[¹⁹f]hx-01在大鼠心肌細胞株h9c2細胞內(nèi)的定位分布特點

利用[¹⁹f]hx-01的自發(fā)綠色熒光，用倒置熒光顯微鏡觀察大鼠心肌細胞株h9c2細胞攝取[¹⁹f]hx-01及其在細胞內(nèi)的定位分布特性，結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出：低濃度6.25μm孵育2小時，鏡下未見確切熒光信號顯示；較低濃度12.5μm孵育2小時，h9c2細胞內(nèi)見微弱綠色熒光出現(xiàn)，定位顯示不清；25μm孵育2小時，h9c2細胞內(nèi)可見明顯熒光信號，熒光主要位于細胞核內(nèi)；隨藥物濃度增加，50μm孵育2小時，細胞內(nèi)熒光信號逐漸增強，細胞核顯示更加清晰，細胞質(zhì)內(nèi)也出現(xiàn)均勻分布的綠色熒光信號；高濃度100μm孵育2小時，細胞核內(nèi)的熒光信號進一步增強，胞質(zhì)內(nèi)熒光信號均勻增高，細胞核內(nèi)熒光明顯高于細胞質(zhì)。

可見，18f標記黃連素衍生物非放射性對照品[¹⁹f]hx-01可以被大鼠心肌細胞攝取，符合心肌灌注顯像劑要求。

2.2[¹⁹f]hx-01在sd乳鼠原代心肌細胞內(nèi)的定位分布特點

利用[¹⁹f]hx-01的自發(fā)綠色熒光，用分辨率更高的共聚焦顯微鏡觀察sd乳鼠原代心肌細胞攝取[¹⁹f]hx-01及其在細胞內(nèi)的定位分布特性，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出：[¹⁹f]hx-01在sd乳鼠原代心肌細胞中分布具有如下特征：低濃度6.25μm孵育2小時，鏡下未見確切熒光信號顯示；較低濃度12.5μm孵育2小時，可見細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淺淡熒光信號；25μm孵育2小時，[¹⁹f]hx-01呈顆粒狀聚集于細胞質(zhì)內(nèi)，呈疏松顆粒狀分布，細胞核內(nèi)幾乎看不到熒光；隨著濃度的增加，較高濃度50μm孵育2小時，細胞質(zhì)內(nèi)的熒光強度逐漸增強，粗顆粒狀密集排列于胞質(zhì)內(nèi)，分布與線粒體分布相似；高濃度100μm孵育2小時，線粒體內(nèi)的熒光信號進一步增強，同時胞核內(nèi)可見少量熒光顯示，[¹⁹f]hx-01部分進入細胞核內(nèi)。

可見，18f標記黃連素衍生物非放射性對照品[¹⁹f]hx-01可以被sd乳鼠原代心肌細胞攝取，符合心肌灌注顯像劑要求。

為了進一步明確[¹⁹f]hx-01在sd大鼠原代心肌細胞亞細胞器內(nèi)的定位特征，在加入上述不同濃度[¹⁹f]hx-01孵育1h后，棄去培養(yǎng)基，用pbs沖洗三次，然后用含有紅色熒光的線粒體特異性探針(mitotrackerred(m7513),thermofisher)的培養(yǎng)基再孵育10min,棄去培養(yǎng)基，用pbs沖洗三次，于共聚焦顯微鏡下觀察[¹⁹f]hx-01的自發(fā)綠色熒光與線粒體特異性探針的紅色熒光分布是否一致。結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出：首先，非放射性標準對照品[¹⁹f]hx-01的自發(fā)熒光綠色熒光主要集中在心肌細胞的線粒體內(nèi)，周圍雜細胞內(nèi)(主要為成纖維細胞)未見明顯綠色熒光信號。心肌細胞線粒體內(nèi)的綠色熒光信號的強度隨著[¹⁹f]hx-01藥物濃度的增加而逐漸增強。在[¹⁹f]hx-01濃度達100μm以后，隨[¹⁹f]hx-01濃度繼續(xù)增高，心肌細胞的細胞核內(nèi)也出現(xiàn)綠色熒光分布，但周圍雜細胞仍未見明顯綠色熒光顯示。

其次，線粒體特異性探針(m7513)的紅色熒光均出現(xiàn)在所有細胞的線粒體內(nèi)，呈顆粒狀分布。心肌細胞線粒體內(nèi)的熒光信號與周圍雜細胞(主要為成纖維細胞)線粒體內(nèi)的熒光強度未見明顯差異。

最后，不同濃度的非放射性標準對照品[¹⁹f]hx-01的自發(fā)綠色熒光信號定位于sd乳鼠原代心肌細胞的線粒體內(nèi)，與線粒體特異性探針(m7513)的紅色熒光信號與在心肌細胞內(nèi)的定位分布高度一致。當[¹⁹f]hx-01濃度明顯增高時，心肌細胞內(nèi)的綠色熒光強度逐漸增高，而心肌細胞線粒體內(nèi)的紅色熒光卻逐漸減弱，說明[¹⁹f]hx-01可以競爭性抑制線粒體特異性探針(m7513)進入sd乳鼠原代心肌細胞線粒體內(nèi)，兩者之間存在線粒體競爭性結(jié)合關(guān)系。

可見，18f標記黃連素衍生物非放射性對照品[¹⁹f]hx-01可以被sd乳鼠原代心肌細胞攝取，并定位于sd乳鼠原代心肌細胞的線粒體內(nèi)，具有心肌細胞靶向性結(jié)合特性，符合心肌灌注顯像劑要求。

2.3比較不同細胞攝取[¹⁸f]hx-01的特性

結(jié)果見圖4-5。

如圖4所示，大鼠心肌細胞h9c2細胞攝取[¹⁸f]hx-01在30分鐘內(nèi)迅速增高，在30分鐘到120分鐘之間攝取緩慢增高，成平臺分布，攝取在120分鐘時達高峰，為2.89％±0.11％；而對照組與cccp抑制組細胞攝取百分比未見明顯差異。

如圖5所示，sd乳鼠原代心肌細胞攝取[¹⁸f]hx-01也表現(xiàn)出在30分鐘內(nèi)攝取百分數(shù)明顯增高，30分鐘攝取百分比2.08％±0.13％，30分鐘到120分鐘內(nèi)緩慢增高，在120分鐘攝取百分數(shù)達高峰，為2.41％±0.03％，正常組與cccp抑制組攝取百分數(shù)未見明顯差別(p>0.05)。而小鼠成纖維細胞nin3t3細胞攝取[¹⁸f]hx-01百分比在5分鐘與120分鐘分別為0.78±0.06、0.91±0.01，期間未見明顯變化，成平臺分布，正常組與cccp抑制組未見明顯差異(p>0.05)。

可見，18f標記黃連素衍生物在大鼠心肌細胞、sd乳鼠原代心肌細胞攝取明顯高于小鼠成纖維細胞，[¹⁸f]hx-01具有親心肌細胞特性，與[¹⁹f]hx-01可靶向分布于心肌細胞的現(xiàn)象一致。18f標記黃連素衍生物可以作為心肌灌注顯像劑。

試驗例2本發(fā)明18f標記黃連素衍生物在健康小鼠體內(nèi)的生物分布

1實驗材料與方法

1.1實驗動物

實驗中使用的昆明小鼠由成都達碩實驗動物公司從北京斯萊克生物有限公司代購，飼養(yǎng)于四川大學(xué)實驗動物中心。

1.2主要試劑

由四川大學(xué)華西醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科制備放射化學(xué)純度(rcp)>99％的目標化合物氟[¹⁸f]hx-01。

生理鹽水購自四川大學(xué)華西醫(yī)院。

1.3主要耗材

新華i號紙，胰島素針，移液器槍頭-規(guī)格：1000μl、200μl、10μl均購自costarstripette公司(newyork,usa)，pe手套、醫(yī)用無粉乳膠手套、口罩均購自kirgenbioscience公司(中國，上海)。

1.4主要儀器

1.5實驗方法

采用經(jīng)尾靜脈定量注射放射化學(xué)純度(rcp)>99％的18f標記黃連素衍生物[¹⁸f]hx-01給正常昆明小鼠，分別于注射后5min、10min、30min、1h、2h、4h處死動物，提取重要臟器組織標本，如血，心，肺，肝，腎，脾，胃，小腸，肌肉，骨骼，腦等，稱重后用γ計數(shù)儀測量各標本的總放射性活度，計算每克組織放射性劑量占注射劑量的百分率(theradioactivitypercentageofinjecteddosepergramoftissue；％id/g)。

具體操作步驟如下：

(1)試驗動物：健康昆明小鼠，4-6周齡，雌、雄各半，平均體重約25g(25g±0.5g)。

(2)放射性藥物[¹⁸f]hx-01：放射化學(xué)純度＞99％，注射劑量約100μci(100μci±10μci)，容積約100μl。取3支試管，每管加入100μl[¹⁸f]hx-01作為標準源對照。

(3)試驗動物分組：生物分布試驗將30只健康昆明小鼠隨機分為6組：5min、10min、30min、1h、2h、4h，每組計劃4-5只鼠，雌、雄各半。

(4)重要臟器組織標本提取及稱重：每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射100μci[¹⁸f]hx-01(100μci±10μci)，約100μl。分別于注射后5min、10min、30min、1h、2h、4h將試驗鼠斷頸處死并測定體重。取心，肺，肝，腎，脾，胃，小腸，肌肉，骨骼，腦等重要臟器組織標本后稱重，用γ放射免疫計數(shù)器(fj-202)測定上述各標本每分鐘放射性計數(shù)，再換算成每克組織放射性劑量占注射劑量的百分率(％id/g)。

(5)實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±sd)表示。

(6)統(tǒng)計學(xué)分析：配對t檢驗，p值＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

健康昆明小鼠各組織器官的放射性生物分布如表1及圖7所示。

表1[¹⁸f]hx-01在正常昆明小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布(％id/g,x±sd,n＝4)

由表1及圖7可見，靜脈注射[¹⁸f]hx-015min后，心臟早期即出現(xiàn)很高的放射性分布：34.84±3.86id％/g，隨著時間延長至注射后4h，攝取值為30.12±0.22id％/g；心臟內(nèi)的放射性持續(xù)保持較高水平，4小時內(nèi)僅有緩慢輕度下降；提示：心肌攝取[¹⁸f]hx-01早、攝取值高且長時間維持在高水平。

肝臟早期攝取放射性較高，后隨時間延長，肝臟的放射性迅速降低；注射后5min及4h肝臟攝取[¹⁸f]hx-01的值分別為15.88±0.04id％/g及5.27±0.97id％/g；如圖6所示，心/肝放射性比率逐漸增高，5min及4h分別為2.18±0.25、5.87±1.22，提示藥物在肝臟代謝。

腎臟的放射性攝取值最高，注射后5min及4h分別為90.43±10.55及19.58±1.39id％/g；提示藥物主要經(jīng)腎臟排泌。

胃腸道的放射性分布亦較高，隨時間延長，其放射性性分布也隨之下降，至4h胃、腸道的放射性分別為8.92±1.28、7.84±0.73；提示藥物除經(jīng)腎臟排泄，還有部分經(jīng)胃腸道排泄。

血液中的放射性分布極低，注射后5min為1.68±0.11id％/g，且藥物從血漿中清除快，如圖6所示心/血5min及4h分別為13.58±0.97、56.28±5.3，隨時間延長心/血放射性比顯著增高；提示藥物的血漿蛋白結(jié)合率低。

全身其余器官組織，如腦、肺、骨、肌肉等攝取[¹⁸f]hx-01均極低，且隨著時間的延長，放射性分布未見明顯變化；而心臟/周圍組織放射性比明顯升高，如圖7所示，心/肺放射性比5min及4h分別為26.08±4.82及94.94±4.71；提示[¹⁸f]hx-01的放射性分布具有組織特異性，具有靶向分布于心臟的特性。

可見，健康小鼠生物分布表明：心肌細胞攝取[¹⁸f]hx-01早、攝取值高，且4h內(nèi)放射性持續(xù)保持在較高水平；心肌周圍組織攝取[¹⁸f]hx-01明顯低于心肌(p＜0.01)，且隨時間進展，周圍組織放射性逐漸降低，可獲得優(yōu)良的心臟與周圍組織如心/肝、心/肺和心/血放射性比率；藥物主要經(jīng)肝臟代謝，主要經(jīng)腎臟排泌，部分經(jīng)腸道排泌；腦、肺、骨、肌肉等主要器官組織攝取藥物極低(p＜0.01)。

因此，本發(fā)明18f標記黃連素衍生物具有優(yōu)良的心肌靶向性分布特性，可以作為心肌灌注顯像劑。

試驗例3本發(fā)明18f標記黃連素衍生物在健康兔的micropet動態(tài)顯像

1實驗材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗試劑

[¹⁸f]hx-01由四川大學(xué)華西醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科制備。生理鹽水、水合氯醛購自四川大學(xué)華西醫(yī)院。

1.1.2實驗動物及其飼養(yǎng)條件

名稱：新西蘭大白兔

等級：清潔級

數(shù)量：各3只

性別：雄性

體重范圍：2.5±0.2kg

來源：成都達碩實驗動物公司從北京斯萊克生物有限公司代購，飼養(yǎng)于四川大學(xué)實驗動物中心。

環(huán)境條件：噪聲＜60db；溫度20-24℃；濕度40％-60％；通風良好。

飲水：水質(zhì)不低于城市生活飲水標準

飼料：全價營養(yǎng)顆粒飼料

1.1.3儀器設(shè)備

1.2實驗方法

1.2.1新西蘭健康大白兔pet動態(tài)顯像

將雄性新西蘭大白兔(n＝3)仰臥位，用綁帶將四肢固定于兔板，10％水合氯醛按3ml/kg量腹腔注射。麻醉成功后，建立耳緣靜脈通道，先經(jīng)此靜脈通道注射2ml生理鹽水，檢查靜脈通道是否通暢。

確認通暢后，經(jīng)新西蘭大白兔耳緣靜脈通道快速靜脈注射示蹤劑[¹⁸f]hx-01，最后再注3ml生理鹽水沖管，拔出針頭，壓迫止血，注射劑量為0.5mci/kg。

圖像采集：靜脈推注[¹⁸f]hx-01后，立即采集顱底至踝關(guān)節(jié)ct圖像。ct采集參數(shù)為40mas,120kev，層厚4mm，層距4mm，矩陣為512×512。然后，分別于第5、15、30、60、90、120min時以2min/床的速度進行pet/ct圖像采集(5床位)。pet圖像采集采用3d采集模式，pet/ct圖像采集完成后，經(jīng)計算機自動重建橫斷面、矢狀面和冠狀面圖像。pet圖像經(jīng)衰減校正后以lor方法重建。經(jīng)syntgra融合軟件，同時得到pet、ct及pet/ct圖像。利用compassview5.0分析處理數(shù)據(jù)，在橫軸位勾畫感興趣區(qū)域(roi)腦、心、肝、肺、腎、骨和肌肉，記錄suvmax。

1.2.2[¹⁸f]hx-01及其非放射性標準品[¹⁹f]hx-01競爭性抑制試驗

麻醉固定后，將雄性新西蘭大白兔設(shè)自身對照(n＝3),第一天經(jīng)兔耳緣靜脈注射2ml的生理鹽水；隨后注射示蹤劑[¹⁸f]hx-01，注射劑量為0.5mci/kg后立即進行pet掃描，方法如1.4.2。第二天經(jīng)耳緣靜脈注射非放射性標準品[¹⁹f]hx-01，標準品劑量為1mol/kg，溶解于2ml生理鹽水中。注射非放射性標準品[¹⁹f]hx-0130min，再注射示蹤劑[¹⁸f]hx-01，注射劑量為0.5mci/kg。完成注射后，進行pet動態(tài)掃描，方法如1.4.2。經(jīng)syntgra融合軟件，同時得到pet、ct及pet/ct圖像。利用compassview5.0分析處理數(shù)據(jù)，在橫軸位勾畫感興趣區(qū)域(roi)腦、心、肝、肺、腎、骨和肌肉，記錄suvmax。

1.2.3統(tǒng)計處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(χ±sd)，應(yīng)用spss21.0統(tǒng)計軟件進行配對t檢驗。

2結(jié)果

2.1新西蘭健康大白兔pet動態(tài)顯像

見圖8-11。

從圖8-9可以看出，兔的心臟表現(xiàn)出放射性均勻攝取增高，隨著時間的延長(2h內(nèi))心肌放射性攝取持續(xù)保持高水平；在5min和110min時，心肌suvmmax分別為5.03±0.27和4.13±0.02。

肝臟開始放射性攝取較高，5min時suvmax最高，為2.84±0.10；之后隨時間進展，放射性逐漸降低，第110min時肝臟suvmax為0.63±0.12，而心/肝放射性比則隨時間明顯增高，如圖10所示：5min及2h分別為1.78±0.16、6.74±0.2；表明藥物在肝臟代謝。

腎臟顯示出最高的放射性攝取，5min及2h腎臟suvmax分別為12.3±1.77、13.48±0.24，隨時間進展，膀胱內(nèi)逐漸見放射性分布濃聚,提示藥物主要從泌尿系排泄。

腸道亦表現(xiàn)出較高的放射性，提示藥物部分經(jīng)腸道排泄。其余組織如：腦、肺、肌肉及骨骼攝取[¹⁸f]hx-01極低(p＜0.01)，且隨著時間的延長，放射性分布未見明顯變化，如圖11所示，心/肺及心/肌肉suvmax比值始終均大于10。

可見：心肌攝取[¹⁸f]hx-01早、攝取值高且分布長時間(2h)保持較高水平；藥物經(jīng)肝臟代謝，主要經(jīng)泌尿系排泄，部分經(jīng)腸道排泄；腦、肺、骨、肌等組織器官內(nèi)放射性分布均極低。

因此，本發(fā)明18f標記黃連素衍生物在新西蘭大白兔體內(nèi)分布具有心肌靶向性及良好的心臟/周圍組織對比。

2.2[¹⁸f]hx-01及其非放射性標準品[¹⁹f]hx-01競爭性抑制試驗

如圖11所示注射了非放射性標準品[¹⁹f]hx-01的抑制組心肌攝取[¹⁸f]hx-01較對照組低，suvmax明顯減小(p＜0.001)；圖12示肝臟攝取[¹⁸f]hx-01隨時間逐漸減低，抑制組及對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；圖14示抑制組及對照組腎臟攝取[¹⁸f]hx-01均最高，隨時間進展攝取未見明顯降低，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而肺(圖13示)、骨、肌肉及腦組織攝取[¹⁸f]hx-01均很低，其suvmax均接近本底，為一極低的值，抑制組及對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。

綜上，本發(fā)明18f標記黃連素衍生物具有良好的心肌靶向分布特性，心臟/周圍組織對比(肝、肺、血液、肌肉、骨骼等)值高，可以作為一種良好的pet心肌顯像劑，應(yīng)用前景良好。