本發(fā)明涉及一種水凝膠，具體涉及一種elp/基因遞送水凝膠，還涉及上述水凝膠的制法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，包括止血，炎癥，血管形成、組織再生、組織重塑和消退，并且需要多種細(xì)胞(例如免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞)和信號(hào)通路的協(xié)調(diào)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在組織損傷后，許多信號(hào)被激活，包括來(lái)自受損鄰近細(xì)胞和微生物的損傷相關(guān)分子模式(damps)和病原體相關(guān)分子模式(pamps)，兩者都將激活各種toll樣受體(tlrs)和比如晚期糖基化最終產(chǎn)物受體(rage)的受體。damps或任何對(duì)傷口邊緣細(xì)胞的膜損傷都會(huì)觸發(fā)ca2+流入細(xì)胞質(zhì)空間。細(xì)胞質(zhì)ca2+可以通過(guò)激活nadph氧化酶和磷脂酶來(lái)誘導(dǎo)過(guò)氧化氫和多不飽和脂肪酸(pufas)的產(chǎn)生。浸潤(rùn)中性粒細(xì)胞識(shí)別這些信號(hào)，使src家族激酶(sfks)的激活，并最終導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白聚合和趨化，并激活nf-κb轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，即觸發(fā)促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄。中性粒細(xì)胞通過(guò)識(shí)別如cxcl8和白三烯b4(ltb4)的炎癥信號(hào)可以減慢移動(dòng)速度并遷移至傷口附近，然后通過(guò)活性氧(ros)的產(chǎn)生、細(xì)胞脫顆粒和中性粒細(xì)胞胞外陷阱(nets)的釋放等方式殺死入侵的病原體，胞葬作用以及il-4和il-13誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞促進(jìn)分解功能。巨噬細(xì)胞從生長(zhǎng)血管尖端的頂端取代抑制性中性粒細(xì)胞，產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子a(vegfa)，促進(jìn)血管的生成。對(duì)于中性粒細(xì)胞胞外陷阱沉積導(dǎo)致的延遲傷口愈合，可以通過(guò)抑制pad4基因活性或敲除pad4基因達(dá)到治療的效果。巨噬細(xì)胞可以通過(guò)wnt,tgfβ,pdgf和relmα等信號(hào)影響成纖維細(xì)胞，參與傷口的愈合。但是其中表達(dá)en1基因的纖維細(xì)胞亞群將導(dǎo)致傷口疤痕的形成，可以通過(guò)阻斷en1基因活化減少疤痕的形成并促進(jìn)傷口愈合再生。巨噬細(xì)胞還可以通過(guò)傳遞fgf(主要是fgf2)、色素上皮衍生因子(pedf)等抑制sprouty2基因從而促進(jìn)傷口處內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化。巨噬細(xì)胞也可以通過(guò)產(chǎn)生vegfr3介導(dǎo)淋巴管的修復(fù)，增加皮膚炎癥中的淋巴密度，加快水腫清楚速度。此外，皮膚富含的γδt細(xì)胞可以產(chǎn)生fgf，其對(duì)角質(zhì)層有營(yíng)養(yǎng)作用并能夠驅(qū)動(dòng)再上皮化，人表皮γδt細(xì)胞還通過(guò)分泌igf1促進(jìn)傷口愈合。表達(dá)vγ5的樹(shù)突狀表皮γδt細(xì)胞(detc)在表皮中進(jìn)行免疫監(jiān)視，并釋放生長(zhǎng)因子成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7(fgf7)和igf1，從而促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖。il-10通過(guò)stat3通路誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)和趨化因子cxcl12從而增加內(nèi)皮祖細(xì)胞(epc)募集和歸巢。增加il-6的表達(dá)可以激活stat3-skint通路從而改善老化皮膚傷口愈合能力。此外，增強(qiáng)b細(xì)胞中的cd19表達(dá)也可以增強(qiáng)傷口的愈合。表皮細(xì)胞產(chǎn)生的wnt配體對(duì)于激活與毛囊相關(guān)的黑素細(xì)胞干細(xì)胞(mcsc)中的wnt通路是必需的，從而促進(jìn)修復(fù)皮膚中表皮黑素細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)傷口愈合。

2、基因藥物可用于傷口愈合，如circrna、質(zhì)粒dna(pdna)、mirna等。通過(guò)設(shè)計(jì)特殊的基因藥物，可以與宿主細(xì)胞的dna、rna或蛋白質(zhì)相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)、調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的產(chǎn)生，最終調(diào)控傷口愈合的整體進(jìn)程，促進(jìn)傷口愈合。但是常見(jiàn)的遞送載體如納米粒等，在皮膚部位的滲透效果有限，因此需要設(shè)計(jì)新型的遞送載體來(lái)增加基因藥物在皮膚的滲透作用，提高治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種可促進(jìn)傷口快速愈合的elp/基因遞送水凝膠，還提供上述水凝膠的制法和應(yīng)用。

2、技術(shù)方案：本發(fā)明公開(kāi)了一種elp/基因遞送水凝膠，由負(fù)載基因藥物的雜化納米粒lpns、彈性蛋白樣多肽elps、添加劑及輔料制得，質(zhì)量比為2:10～100:0～300:1～400。

3、其中，所述雜化納米粒lpns由pla-phis、基因藥物、陽(yáng)離子脂質(zhì)材料、功能性磷脂、固醇和兩親性聚合物制得，質(zhì)量比為100-300:1-20:10-150:10-150:5-150:1-100。

4、其中，所述基因藥物為pdna、sirna、mirna、circrna、mrna、aso、ssdna或ssrna中的一種或多種；所述陽(yáng)離子脂質(zhì)材料，包括dc-膽固醇、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰膽堿或二硬脂酰磷脂酰膽堿的一種或多種；所述功能性磷脂，包括二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二油?；蚜字?、二棕櫚酸磷脂酰膽堿、二硬脂?；字Ｄ憠A、二油酰磷脂酰乙醇胺的一種或多種；所述固醇，包括膽固醇、dc-膽固醇、羊毛固醇、谷甾醇、豆固醇或麥角固醇的一種或多種；所述兩親性聚合物dspe-peg2000、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇、磷脂酰膽堿-聚乙二醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或二硬脂酰磷脂酰膽堿-聚乙二醇的一種或多種。

5、其中，所述雜化納米粒lpns的制備方法包括納米沉淀法、溶劑蒸發(fā)法、自發(fā)乳化溶劑擴(kuò)散法、鹽析乳化-擴(kuò)散法、超臨界流體技術(shù)、親水性聚合物凝聚法、乳液聚合或界面聚合法。

6、所述制備方法進(jìn)一步優(yōu)選為，采用納米沉淀法制備雜化納米粒：將處方量的pla-phis、陽(yáng)離子脂質(zhì)材料溶于dmso，將處方量的功能性磷脂、固醇和兩親性聚合物溶于thf，水浴超聲溶解，作為有機(jī)相；將質(zhì)粒溶液作為水相。在茄型燒瓶中加入適量質(zhì)粒溶液，并用10％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph至1。劇烈磁力攪拌下將有機(jī)相滴加進(jìn)水相中，攪拌均勻后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去殘留的thf，并用ph?6.5hepes溶液透析1h，即得搭載基因藥物的雜化納米粒；

7、或采用微流控技術(shù)制備雜化納米粒：精密稱(chēng)取處方量的pla-phis、陽(yáng)離子脂質(zhì)材料，加入dmso并超聲至完全溶解；精密稱(chēng)取處方量的功能性磷脂、固醇和兩親性聚合物，加入thf并超聲至完全溶解；將上述溶液混合作為有機(jī)相。取處方量ssdna加水溶解，作為水相。分別在微流控的兩相注入口加入對(duì)應(yīng)的溶液，通過(guò)程序?qū)⑺嗪陀袡C(jī)相進(jìn)行均勻混合，收集口處所得制劑用pbs進(jìn)行40倍稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)超濾去除有機(jī)相，即得搭載基因藥物的雜化納米粒。

8、其中，所述彈性蛋白樣多肽elps為包括至少一段重復(fù)的的五肽基序vpgxg，其中x為纈氨酸或賴(lài)氨酸，其比例為7:1。進(jìn)一步優(yōu)選為，elps肽鏈上連接絲素蛋白(gagags)。其具有溫敏性，在低溫情況下呈液體，在高于一定溫度時(shí)elps單體通過(guò)疏水作用促進(jìn)多肽折疊及動(dòng)態(tài)組裝從而轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(如β-螺旋)，進(jìn)而凝固。

9、其中，所述輔料為泊洛沙姆、殼聚糖、纖維素、甲基纖維素、淀粉、海藻酸、透明質(zhì)酸、膠原、聚l-賴(lài)氨酸、聚l-谷胺酸、丙烯酸、聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚丙烯酰胺或聚n-聚代丙烯酰胺中的一種或多種；所述添加劑為β-甘油磷酸鈉或甘油的一種或兩種組合。

10、上述水凝膠的制法，包括以下步驟：

11、(1)取pla-phis、脂質(zhì)材料、基因藥物，制得雜化納米粒lpns；

12、(2)取彈性蛋白樣多肽elps的凍干粉末和雜化納米粒lpns制得混合水溶液，加入輔料及添加劑，冰浴攪拌至完全溶解即得elp/基因遞送水凝膠。

13、本發(fā)明還公開(kāi)了上述水凝膠在制備創(chuàng)口愈合類(lèi)藥物或醫(yī)療器械中的應(yīng)用。

14、發(fā)明原理：本發(fā)明的elp/基因遞送水凝膠，以搭載基因藥物的雜化納米粒(lpns)和類(lèi)彈性聚多肽(elps)為原料，結(jié)合合適的輔料及添加劑，達(dá)到促進(jìn)傷口快速愈合的效果。搭載基因藥物的雜化納米粒(lpns)能夠調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)(如敲除或抑制pad4基因、sprouty2基因)、調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的產(chǎn)生(如增加fgf7蛋白、il-4和il-13的表達(dá))，進(jìn)而調(diào)控傷口愈合的整體進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)傷口的愈合；選擇不同輔料加入載有基因藥物的雜化納米粒(lpns)的凝膠中，可以改善凝膠的性狀；同時(shí)，類(lèi)彈性聚多肽(elps)具有可逆相變特性，在低溫液態(tài)的狀態(tài)下對(duì)傷口進(jìn)行較完整地填充，然后由于體溫高于凝膠設(shè)計(jì)的相轉(zhuǎn)變溫度，液態(tài)elps凝膠轉(zhuǎn)化為固態(tài)，便于傷口敷料的固定，通過(guò)加入其他輔助膠凝物質(zhì)如泊洛沙姆等改善低濃度elps凝膠的膠凝特性，結(jié)合搭載基因藥物的雜化納米粒(lpns)可以改善雜化納米粒(lpns)的透皮效果，加入不同輔料修飾的彈性蛋白樣多肽(elps)凝膠能夠促進(jìn)載有基因藥物的雜化納米粒(lpns)的釋放，如圖1所示，加快細(xì)胞的增殖和細(xì)胞遷移，使傷口愈合速度加快。

15、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)：(1)elp/基因遞送水凝膠加快細(xì)胞的增殖和細(xì)胞遷移，使傷口愈合速度加快；為傷口創(chuàng)造無(wú)菌環(huán)境，阻礙細(xì)菌感染傷口；防止色素沉著；(2)其制法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本較低，易于大規(guī)模生產(chǎn)。