本發(fā)明涉及納米，尤其是涉及一種葡萄糖修飾的載生物活性物質(zhì)納米顆粒及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、近年來，納米技術(shù)的進(jìn)步使得納米載體可以將治療或診斷藥物輸送到身體的病變部位，但是設(shè)計(jì)通過低滲透性血管屏障運(yùn)輸生物活性物質(zhì)的納米載體仍具有挑戰(zhàn)性。血腦屏障(bbb)是人體內(nèi)三大屏障系統(tǒng)之一，主要由周細(xì)胞、腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞(bcecs)、基膜、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接組成。該屏障具有嚴(yán)格的選擇透過性，只有分子量小于450的小分子才能穿透bbb，極大限制了用于治療中樞神經(jīng)疾病的藥物或具有優(yōu)良調(diào)控活性的生物分子進(jìn)入腦部。因此急需開發(fā)一種即可負(fù)載藥物又能穿過bbb的納米載體。

2、分子穿透bbb的途徑主要有被動擴(kuò)散、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)以及胞吞作用。納米載體作為一種優(yōu)良的遞送體系被廣泛應(yīng)用于活性物質(zhì)的包埋遞送研究，當(dāng)前已有利用納米載體載藥穿過bbb靶向進(jìn)入大腦的研究。例如：載替莫唑胺的納米顆粒通過搭載外周巨噬細(xì)胞借助淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)方式穿過bbb進(jìn)入大腦，到達(dá)病變部位釋放藥物；表面修飾聚山梨醇酯80或附著有載脂蛋白e的納米顆粒與血腦屏障上的載脂蛋白受體相互作用，因內(nèi)吞進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，并可能胞吞進(jìn)入大腦通過血腦屏障傳遞藥物；含轉(zhuǎn)鐵蛋白的金納米顆?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的胞吞途徑從全身給藥中到達(dá)腦實(shí)質(zhì)。然而納米載體壁材的選擇對于其應(yīng)用場景具有限制性，應(yīng)用于人體的材料需具有優(yōu)良的生物相容性、可降解性，并且無毒性，目前食品級材料在腦靶向遞送中的研究有限。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了提供一種葡萄糖修飾的載生物活性物質(zhì)納米顆粒及其制備方法與應(yīng)用，借助納米顆粒通過bbb遞送生物活性物質(zhì)，以解決bbb阻礙生物活性物質(zhì)進(jìn)入大腦發(fā)揮效用的問題。

2、本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種葡萄糖修飾的載生物活性物質(zhì)納米顆粒，包括連接有葡萄糖的大豆分離蛋白和其上負(fù)載的生物活性物質(zhì)。

3、本發(fā)明中，納米顆粒表面修飾有葡萄糖，且載有生物活性物質(zhì)，納米顆粒包括如下各組分：連接葡萄糖的大豆分離蛋白、負(fù)載的生物活性物質(zhì)。大豆分離蛋白是食品原料，具有良好的功能特性，是制備納米顆粒的優(yōu)質(zhì)壁材。葡萄糖是大腦中的主要能量來源，與bcecs中的許多其他受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相比，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(glut1)表達(dá)水平非常高，可以作為納米載體靶向遞送的通道。因此，本發(fā)明將大豆分離蛋白與葡萄糖連接后的產(chǎn)物用于負(fù)載生物活性物質(zhì)，借助葡萄糖靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上glut1，穿過bbb進(jìn)入腦部，實(shí)現(xiàn)生物活性物質(zhì)的靶向遞送。

4、優(yōu)選地，所述大豆分離蛋白與葡萄糖的質(zhì)量比為(10-20)：1。

5、優(yōu)選地，所述連接有葡萄糖的大豆分離蛋白與生物活性物質(zhì)的質(zhì)量比為(20-40)：1。

6、優(yōu)選地，所述生物活性物質(zhì)為高疏水性小分子化合物。

7、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述生物活性物質(zhì)為多酚類小分子化合物。

8、更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述生物活性物質(zhì)包括牡荊素。

9、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述連接有葡萄糖的大豆分離蛋白與牡荊素的質(zhì)量比為(20-40)：1。

10、優(yōu)選地，所述納米顆粒的平均粒徑為100-200nm。

11、制備所述納米顆粒的原料包括：大豆分離蛋白、氨基葡萄糖、負(fù)載的生物活性物質(zhì)。本發(fā)明采用酶法糖基化反應(yīng)，用tg酶將葡萄糖接到蛋白上。

12、一種上述葡萄糖修飾的載生物活性物質(zhì)納米顆粒的制備方法，將連接葡萄糖的大豆分離蛋白、負(fù)載的生物活性物質(zhì)按比例加入去離子水中，攪拌，經(jīng)超聲、離心制備得到所述納米顆粒。

13、一種上述葡萄糖修飾的載生物活性物質(zhì)納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

14、(a)將大豆分離蛋白與d-氨基葡萄糖溶于去離子水，調(diào)節(jié)ph，加入tgase酶(谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，工作濃度9-11u/g)進(jìn)行酶解反應(yīng)，結(jié)束后，滅活tgase酶，冷卻至環(huán)境溫度后4℃蒸餾水透析過夜，凍干后磨粉得到連接有葡萄糖的大豆分離蛋白；

15、(b)將連接有葡萄糖的大豆分離蛋白與生物活性物質(zhì)在去離子水中攪拌得到混合液；

16、(c)將混合液冰浴超聲分散，離心后取上清液，得到葡萄糖修飾的載生物活性物質(zhì)納米顆粒。

17、優(yōu)選地，步驟(a)調(diào)節(jié)ph至8-9。

18、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(a)調(diào)節(jié)ph至8.5。

19、優(yōu)選地，步驟(a)加入tgase酶后，35-40℃下反應(yīng)5-7h后80-90℃加熱4-6min，滅活tgase酶。

20、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(a)加入tgase酶后，37℃下反應(yīng)6h后85℃加熱5min，滅活tgase酶。

21、優(yōu)選地，步驟(a)tgase酶的工作濃度為10u/g。

22、優(yōu)選地，步驟(b)所述攪拌在常溫條件下進(jìn)行，600-800rpm攪拌1.5-2.5h。

23、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(b)在常溫下700rpm磁力攪拌2h后調(diào)節(jié)ph到7.0。

24、優(yōu)選地，步驟(c)所述冰浴超聲時(shí)間為8-12min，超聲功率為90-100w。

25、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(c)冰浴超聲時(shí)間為10min。

26、一種葡萄糖修飾的載牡荊素納米顆粒，其制備方法包括如下步驟：

27、(a)大豆分離蛋白與d-氨基葡萄糖溶于去離子水，調(diào)節(jié)ph，加入tgase酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，結(jié)束后，滅活tgase酶，冷卻至環(huán)境溫度后4℃蒸餾水透析過夜，凍干后磨粉即得連接葡萄糖的大豆分離蛋白；

28、(b)將上述步驟(a)所得產(chǎn)物與生物活性物質(zhì)混合，常溫在去離子水?dāng)嚢?h；

29、(c)將上述步驟(b)所得產(chǎn)物冰浴超聲分散，冰浴超聲時(shí)間為10min，超聲功率為90-100w；

30、(d)將上述步驟(c)所得產(chǎn)物經(jīng)離心后取上清液，得到表面修飾有葡萄糖的載牡荊素的納米顆粒d-spi。

31、一種上述葡萄糖修飾的載生物活性物質(zhì)納米顆粒的應(yīng)用，將所述納米顆粒用于制備腦靶向遞送藥物。

32、優(yōu)選地，將所述納米顆粒用于制備靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上glut1的遞送藥物。

33、優(yōu)選地，所述腦靶向藥物為口服給藥型藥物。

34、優(yōu)選地，所述腦靶向藥物的使用劑量為4-6mg生物活性物質(zhì)/kg體重。

35、一種上述葡萄糖修飾的載生物活性物質(zhì)納米顆粒在促進(jìn)生物活性小分子物質(zhì)穿過血腦屏障進(jìn)入大腦和提高生物活性小分子物質(zhì)利用度方面的用途。

36、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

37、1.本發(fā)明生物活性物質(zhì)借助葡萄糖靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受體穿過血腦屏障進(jìn)入大腦，可解決血腦屏障阻礙不能進(jìn)入大腦的問題；

38、2.本發(fā)明葡萄糖修飾的載生物活性物質(zhì)納米顆粒，所用壁材生物相容性好、安全性高，制備方法簡便、易于控制和操作、無有毒有機(jī)溶劑殘留，可顯著促活性物質(zhì)穿過血腦屏障進(jìn)入大腦，提高生物利用度；

39、3.本發(fā)明制備得到的納米粒平均粒徑在180nm左右，對腦細(xì)胞無毒性，可促進(jìn)生物活性物質(zhì)進(jìn)入大腦；

40、4.本發(fā)明提供了一種靶向glut1的載生物活性物質(zhì)納米顆粒及其制備方法，借助納米顆粒通過bbb高效遞送生物活性物質(zhì)，以解決bbb阻礙生物活性物質(zhì)進(jìn)入大腦發(fā)揮效用的問題。