本發(fā)明屬于滅活疫苗領域，具體涉及一種豬支原體肺炎高效滅活疫苗及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、豬支原體肺炎(mps)又稱地方性流行性肺炎，是由豬肺炎支原體(mycoplasmahyopneumoniae，mhp)引起的一種接觸性慢性呼吸性傳染病。豬肺炎支原體mhp是一種微小的微生物，主要寄生于豬的呼吸道上皮細胞中，通過破壞上皮表面的纖毛影響?zhàn)つで宄到y(tǒng)，進而影響呼吸道的免疫系統(tǒng)。mhp一旦感染，其菌株在動物體內(nèi)會持續(xù)存在至少12周，這意味著感染后的動物免疫反應不能迅速將其從呼吸道中清除，因此，mhp還可能使動物容易同時感染其他病原體，包括細菌、寄生蟲和病毒等。此外，mhp可以通過直接接觸或空氣飛沫在豬群之間傳播，感染后的豬主要表現(xiàn)為長時間的咳嗽和氣喘、呼吸困難、生長遲緩等癥狀，且這些癥狀可能會逐漸加重，在嚴重的情況下，可能導致豬的死亡。這些患病豬剖解時以肺部病變?yōu)橹?，出現(xiàn)“肉變樣”或“胰變樣”等實質(zhì)性病變。

2、目前，豬支原體肺炎在世界范圍內(nèi)高度流行，mhp感染主要影響豬的生長和發(fā)育，由于不同階段的豬均能感染豬支原體肺炎，傳染性強，感染率高，常常繼發(fā)其他病原的感染，導致飼料利用率降低，出欄時間延長，給豬業(yè)養(yǎng)殖造成非常明顯的影響，帶來重大經(jīng)濟損失。

3、為了預防和控制豬支原體肺炎，養(yǎng)殖戶需要采取一系列的措施。其中，疫苗接種是防治豬支原體肺炎的重要方法。但是，mhp的生長條件相對較為特殊，體外培養(yǎng)條件苛刻，對營養(yǎng)成分的要求較高，需要特定的營養(yǎng)物質(zhì)來維持其生長和繁殖。然而，目前對于mhp的營養(yǎng)需求了解尚不全面，導致培養(yǎng)基的配方可能不夠精準，難以滿足mhp的生長需求。因此，目前為止僅有少數(shù)支原體能夠在體外生長。friis培養(yǎng)基作為一種用于培養(yǎng)特定微生物(如mhp)的專用培養(yǎng)基，雖然在一定程度上能夠滿足實驗需求，但仍存在一些問題和局限性。friis培養(yǎng)基的配方可能無法完全滿足mhp等微生物的全部營養(yǎng)需求，這可能導致微生物在培養(yǎng)基中的生長速度較慢，或者無法充分表達其生物學特性。因此，mhp的體外培養(yǎng)仍然是其疫苗制備需要攻克的首要難關。

4、因此，針對豬支原體肺炎菌種體外培養(yǎng)技術(shù)、豬支原體肺炎疫苗的制備技術(shù)等進行研究，探索新的mhp疫苗制備技術(shù)和策略，具有非常重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明旨在提供一種豬支原體肺炎高效滅活疫苗及其制備方法，針對豬支原體肺炎菌種體外培養(yǎng)技術(shù)、豬支原體肺炎疫苗的制備技術(shù)等進行改進，制備疫苗的工藝簡單且所制備的滅活疫苗免疫動物后免疫效果好，提高了疫苗的質(zhì)量。

2、為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一個目的是提供一種豬支原體肺炎高效滅活疫苗，所述滅活疫苗為佐劑混合疫苗，由蛋白濃度為200～250μg/ml的滅活豬肺炎支原體菌液與isa76vg佐劑按照1:1～3的體積比混合組成。

4、優(yōu)選的，所述滅活豬肺炎支原體菌液的培養(yǎng)方法包括：

5、(1)一級種子繁殖：將豬肺炎支原體生產(chǎn)用菌種按5～15％比例接種于含5～15％豬肺浸液的mh液體培養(yǎng)基，30～40℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基顏色變黃，ph值降至6.5～7.0時收獲菌液，作為一級種子；

6、(2)二級種子繁殖：將一級種子按10～18％比例接種于含5～15％豬肺浸液的mh液體培養(yǎng)基，30～40℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基顏色變黃，ph值降至6.5～7.0時收獲菌液，作為二級種子；

7、(3)菌液繁殖：將二級種子按10～18％比例接種含5～15％豬肺浸液的mh液體培養(yǎng)基，30～40℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基顏色變黃，ph降至6.5～7.0，收獲菌液，得到豬肺炎支原體菌液；

8、(4)將豬肺炎支原體菌液進行純粹檢驗和活菌滴度測定，然后加入滅活劑進行滅活，檢測滅活菌液蛋白濃度，制得滅活豬肺炎支原體菌液。

9、優(yōu)選的，所述豬肺浸液是通過豬肺組織進行消化制備，具體包括如下步驟：

10、將豬肺組織按照質(zhì)量體積比為2：20～30料液比添加磷酸鹽緩沖液制備勻漿；調(diào)節(jié)ph至6.0～8.0，加入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶各3800～4200u/g，攪拌均勻；放入50～60℃的水浴鍋中反應，在10、20、30、90、180、300和360min時及時混勻；置于沸水中滅活8～15min；取出冷卻至室溫，無菌操作分裝至ep管中，2500～3000r/min離心3～8min去除沉淀，吸取上清分裝，置于-30～40℃保存。

11、優(yōu)選的，步驟(4)中所述純粹檢驗，包括采用活菌純粹檢驗法對豬肺炎支原體菌液進行純粹檢驗。

12、優(yōu)選的，所述活菌純粹檢驗法包括：將豬肺炎支原體菌液分別接種8～12％?mh液體培養(yǎng)基和0.1～0.5mlmh固體培養(yǎng)基，35～40℃培養(yǎng)觀察8～12日，觀察菌液生長情況和菌落形態(tài)，同時接種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基tg、酪胨瓊脂ga和鮮血瓊脂斜面培養(yǎng)基各2支，每支0.2ml，1支置35～40℃培養(yǎng)，1支置23～27℃培養(yǎng)；接種葡萄糖蛋白胨湯gp?1支，每支0.2ml，置23～27℃培養(yǎng)，觀察4～6日，記錄結(jié)果。

13、優(yōu)選的，步驟(4)中所述活菌滴度測定包括：取11支無菌試管，每管裝4.5ml含5～15％豬肺浸液的mh液體培養(yǎng)基，在第1管加入0.5ml豬肺炎支原體菌液培養(yǎng)物，混合均勻后取0.5ml加入第2管，如此連續(xù)進行10倍系列稀釋至10-10，同時設未加菌液的含5～15％豬肺浸液的mh液體培養(yǎng)基為陰性對照，置37±1℃培養(yǎng)12～16日，以培養(yǎng)基ph下降0.5以下最末1管作為菌液的ccu。

14、優(yōu)選的，步驟(4)中所述滅活劑為濃度為0.5～2.0％的硫柳汞溶液，其終濃度達到0.005～0.02％；加入滅活劑后置2～8℃滅活24小時，期間振搖2次；所述滅活菌液蛋白濃度應≥4.3mg/ml。

15、本發(fā)明的第二個目的是提供一種如上述豬支原體肺炎高效滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：

16、s1、水相的制備：將滅活豬肺炎支原體菌液用緩沖液稀釋成蛋白濃度為200～250μg/ml的豬肺炎支原體菌液，制得水相；

17、s2、油相的制備：將76vg佐劑裝入滅菌瓶內(nèi)，120～130℃高壓滅菌30～40分鐘，冷卻后備用，制得油相；

18、s3、乳化：將水相與油相按1:1～3(w/w)比例乳化；

19、s4、將乳化后的疫苗充分搖勻，進行定量分裝，加蓋密封，即得。

20、優(yōu)選的，步驟s3中所述乳化過程包括：

21、先將油相加入剪切機內(nèi)，1200～1800r/min攪拌的同時緩緩加入水相后，以10000～15000r/min攪拌3～10分鐘，制得油乳劑滅活疫苗。

22、優(yōu)選的，所述緩沖液為tris-nacl緩沖液。

23、本發(fā)明的設計原理或構(gòu)思：

24、本發(fā)明提供了一種創(chuàng)新的疫苗制備方法，該方法的核心在于采用了一種獨特且優(yōu)化的培養(yǎng)基，本發(fā)明采用含5～15％豬肺浸液的mh液體培養(yǎng)基對豬肺炎支原體mhp進行培養(yǎng)，不僅為mhp的生長提供了理想的營養(yǎng)環(huán)境，還通過其特殊的成分組合和濃度配比，顯著提升了mhp的培養(yǎng)效率和抗原表達能力。

25、傳統(tǒng)的疫苗制備過程中，培養(yǎng)基的選擇往往是一個關鍵的步驟。不同的培養(yǎng)基對于mhp的生長和抗原表達具有不同的影響。而本發(fā)明所采用的培養(yǎng)基，經(jīng)過精心設計和實驗驗證，能夠最大限度地滿足mhp在生長過程中對營養(yǎng)物質(zhì)的需求，同時促進mhp內(nèi)抗原基因的表達，從而顯著提升疫苗的滴度和抗原含量。通過使用這種優(yōu)化后的培養(yǎng)基，本發(fā)明中的疫苗制備方法在菌種培養(yǎng)階段就展現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢。mhp在培養(yǎng)過程中生長迅速，繁殖能力強，能夠在短時間內(nèi)達到較高的細胞密度。同時，細菌內(nèi)的抗原基因也得到了充分表達，使得疫苗中的抗原含量大幅度提升。這種提升不僅使得疫苗在預防疾病方面具有更強的免疫效果，還能夠減少接種劑量，降低生產(chǎn)成本。此外，由于抗原含量的增加，疫苗在儲存和運輸過程中也表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，能夠更好地保持其免疫效力。

26、綜上所述，本發(fā)明提供的疫苗制備方法通過采用一種優(yōu)化的培養(yǎng)基，顯著提升了菌種的培養(yǎng)效率和抗原表達能力，使得疫苗在預防疾病方面具有更強的免疫效果，并且具有更好的穩(wěn)定性和更低的成本。這種創(chuàng)新的方法為疫苗制備領域帶來了新的突破和進展。

27、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

28、本發(fā)明提供了一種創(chuàng)新的豬支原體肺炎高效滅活疫苗及其制備方法，本發(fā)明采用含5～15％豬肺浸液的mh液體培養(yǎng)基對豬肺炎支原體mhp進行培養(yǎng)，不僅為mhp的生長提供了理想的營養(yǎng)環(huán)境，還通過其特殊的成分組合和濃度配比，顯著提升了mhp的培養(yǎng)效率和抗原表達能力，培養(yǎng)的豬肺炎支原體菌液滴度高，保證了菌種的質(zhì)量；其次，本發(fā)明提供的疫苗制備方法，通過培養(yǎng)物的蛋白濃度測定進行疫苗配置，進一步提高了疫苗的質(zhì)量，免疫動物從各項檢測指標均得到很好的效果；最后，采用本發(fā)明的培養(yǎng)方法或疫苗制備方法制得的豬支原體肺炎滅活疫苗具有高效、安全性高、免疫保護力強等的功效。