發(fā)明領域本發(fā)明提供了用于某些肌肉、神經(jīng)和不育疾病或狀況的治療的穩(wěn)定的無定形碳酸鈣(acc)。此外，穩(wěn)定的acc可以在不同的輔助生殖技術中使用，例如用于促進哺乳動物胚胎生長或用于精子質量的改進。

背景技術：

0、發(fā)明背景

1、在臨床前和臨床生物利用度模型中已經(jīng)示出了，acc的施用導致了鈣生物利用度的促進(meiron等人，j?bone?miner?res.2011,26(2):364-72，shaltiel等人，health?5,2013,18-29，和vaisman等人，journal?of?bone?and?mineral?research,2014,29(10),pp2203-2209)，這是一種在緩解鈣吸收不良相關狀況和紊亂方面特別重要的作用。acc的口服施用導致了對骨參數(shù)的積極影響，這由在骨質疏松預防模型中的抗再吸收行為、合成代謝作用和骨機械強度的維持所展示(shaltiel等人)。wo?2013/088440公開了無定形碳酸鈣組合物，用于在治療鈣吸收不良和吸收不良相關的紊亂、疾病和狀況中使用，以及用于在鈣吸收不良和骨代謝相關紊亂中增加骨礦物質密度中使用。

2、wo?2005/115414描述了包含穩(wěn)定acc的口服可施用的組合物以及用于治療骨質疏松、骨軟化和相關疾病的方法。wo?2008/041236描述了含有無定形或微晶碳酸鈣的制劑，其在治療各種病理狀況，包括增殖性疾病、神經(jīng)紊亂和肌肉骨骼紊亂中是有效的。wo?2009/053967描述了含有無定形碳酸鈣(acc)以及至少一種磷酸化的氨基酸或磷酸化的肽的組合物。所述組合物可以被用于其中列出的各種疾病的治療。

3、神經(jīng)損傷在臨床實踐中是常見的。存在許多實例，其中由事故或類似情況引起的外周神經(jīng)損害不能完全恢復。還存在許多臨床實例，其中作為外科手術的結果，外周神經(jīng)一般必須被摘除。盡管中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)具有神經(jīng)纖維的長且弱的自我修復，外周神經(jīng)系統(tǒng)(pns)具有通過快速神經(jīng)纖維再生修復神經(jīng)的能力。關于損傷后pns功能性恢復的研究已經(jīng)成為一個快速發(fā)展的領域，致力于尋找用于幫助和引導軸突再生的合適方法。

4、已經(jīng)開發(fā)了各種手段來嘗試再生損傷的外周神經(jīng)。一種這樣的技術涉及切斷的神經(jīng)(severed?nerve)的近端和遠端的實際縫合。已經(jīng)積極地追求了用于引導切斷的再生的軸突、縫合在近端和遠端神經(jīng)殘端之間的各種導管的使用。

5、目前缺少充分治療的另外的疾病涉及肌營養(yǎng)不良癥。肌營養(yǎng)不良癥是一組削弱肌肉骨骼系統(tǒng)并妨礙運動(locomotion)的肌肉疾病。肌營養(yǎng)不良癥以進行性骨骼肌無力、肌肉蛋白缺陷以及肌肉細胞和組織的死亡為特征。這樣的疾病的一種是杜氏肌營養(yǎng)不良癥(dmd)，一種致命的肌肉萎縮疾病(muscle?wasting?disease)，影響大約3500個男孩中的一個。杜氏男孩具有約20年的有限預期壽命。該紊亂由在肌萎縮蛋白基因中的突變造成；許多不同的突變已經(jīng)被鑒定為導致蛋白肌萎縮蛋白的功能失調(dysfunction)。它以進行性骨骼肌萎縮及退行為特征(shin等人int?j?biochem?cell?biol.2013，45(10):2266-79)，其也涉及非正常的鈣內(nèi)穩(wěn)態(tài)。肌營養(yǎng)不良癥的醫(yī)學管理已經(jīng)包括了皮質類固醇的使用；然而，盡管皮質類固醇具有相當?shù)挠幸嫘Ч?，長期使用皮質類固醇的治療可導致骨質疏松。即使沒有皮質類固醇，杜氏肌營養(yǎng)不良癥也會導致降低的行動能力，這本身與增加的骨折幾率和降低的骨礦物質密度相關(nanette等人，phys?med?rehabil?clin?n?am.2012,23(4):773-99)。

6、目前，對于dmd或神經(jīng)損傷還不存在令人滿意的治療，并且減輕癥狀的嚴重程度以及改進患有這些狀況的患者的生活質量可以被認為是一種成就。

7、輔助生殖技術(art)領域旨在解決雄性和雌性兩者的不育問題。主要技術中的一種是體外受精(ivf)。細胞培養(yǎng)基的內(nèi)含物可顯著地影響受精和胚胎發(fā)育，并且因此從而影響該程序的結果。ivf的成功率主要與轉移的胚胎數(shù)和因素例如胚胎質量相關。更換培養(yǎng)基可顯著地影響體外胚胎發(fā)育。由于提高胚胎質量和達到高級(advanced)發(fā)育階段的胚胎數(shù)量可增加成功受孕的幾率，尋找用于體外胚胎發(fā)育的最佳條件可以提高整個ivf過程的效率。

8、“雄性因素”不育被視為是在兩個相隔1周和4周收集的精子分析物中的至少一個樣品中精子濃度和/或運動性和/或形態(tài)的改變。在人中，它占不育的40-50％，并且影響所有男性的大約7％。雄性不育通常是由于由低精子計數(shù)、運動性和精子的非正常形態(tài)所反映的在精液或精液質量方面的不足(kumar和singh，2015，j.hum.reprod.sci.，8(4):191-196)。

9、大多數(shù)art技術，例如宮腔內(nèi)人工授精或常規(guī)ivf要求精子至少正常的運動性。目前存在多種用于精子選擇的方法，例如，典型的洗滌上游(swim-up)技術被用以基于自然精子運動性來選擇最活躍的細胞。被選擇的精子可以從而被使用在ivf程序中。無數(shù)用于體外精子改善的技術被建議。體外實驗的結果表明，維生素e可以保護精蟲(spermatozoa)免受氧化損傷和運動性的喪失，并在倉鼠卵細胞穿透測定中促進精子的表現(xiàn)(agarwal&sekhon，human?fertility，december?2010，13(4):217-225)。bhoumik等人(cellbiochem.biophys.，2014,70:1177-1183)展示了，ca2+離子向無鈣培養(yǎng)基的添加增加精子向前運動性高達20％。

10、世界范圍內(nèi)雄性不育的現(xiàn)象正在增加(kumar和singh)，越來越多的夫婦轉向輔助生殖技術。因此，需要用于改進精子體外運動性的新方法。

技術實現(xiàn)思路

0、發(fā)明概述

1、已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，無定形碳酸鈣(acc)可以積極地促進細胞的再生、發(fā)育、成熟和分化。本發(fā)明部分地基于出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即acc加速神經(jīng)纖維再生、推動肌管形成、改善精子質量并促進胚胎發(fā)育，包括但不限于增加達到高級發(fā)育階段的胚胎數(shù)量。

2、在一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無定形碳酸鈣(acc)，用于在治療與神經(jīng)肌肉缺陷相關的疾病或狀況中使用。根據(jù)特定的實施方案，疾病或狀況選自肌營養(yǎng)不良癥和軸突缺陷。根據(jù)一些實施方案，藥物組合物用于在治療軸突缺陷，例如軸突損害中使用。根據(jù)另一個實施方案，藥物組合物用于在治療肌營養(yǎng)不良癥，例如杜氏肌營養(yǎng)不良癥中使用。根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供了用于在有相應需要的受試者中治療選自肌營養(yǎng)不良癥和軸突缺陷的疾病或狀況的方法，包括向所述受試者施用包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無定形碳酸鈣(acc)的藥學上可接受的組合物。

3、根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了用于體外受精的方法，包括(a)使哺乳動物卵母細胞體外受精；以及(b)體外培養(yǎng)胚胎，其中步驟(a)、步驟(b)或步驟(a)和(b)兩者在包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc的細胞培養(yǎng)基中進行。在一些實施方案中，該方法可以進一步包括在步驟(a)之前，在包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc的細胞培養(yǎng)基中卵母細胞的體外成熟的步驟。根據(jù)一些實施方案，哺乳動物選自人和非人哺乳動物。

4、根據(jù)某些方面，本發(fā)明提供了用于改進或改善精子質量的方法，包括將精子暴露于由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無定形碳酸鈣(acc)。根據(jù)一些實施方案，該方法包括將精子暴露于由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc或使精子與由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc接觸。根據(jù)一個實施方案，精子是人精子。根據(jù)另一個實施方案，改進精子質量包括促進精子運動性、促進精子前向運動性、增加精子計數(shù)，因此，本發(fā)明的方法包括促進精子運動性、促進精子前向運動性、增加精子計數(shù)。

5、根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明提供了用于分離攜帶x染色體和y染色體的精子細胞的方法，所述方法包括：(a)使精子樣品與由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc接觸，(b)進行上游程序，(c)獲得包含活動精子(motile?sperm)的級分，以及(d)分離步驟(c)中獲得的級分的上相和下相，其中所述上相富集有攜帶y染色體的精子，并且所述下相富集有攜帶x染色體的精子。

6、根據(jù)又另一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無定形碳酸鈣(acc)，用于在治療雄性不育中使用。

7、根據(jù)一些方面，本發(fā)明提供了用于在有相應需要的受試者中治療雄性不育的方法，包括向所述受試者所述受試者施用包含有效量的由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無定形碳酸鈣(acc)的藥物組合物。

8、根據(jù)上述方面中的任何一個，acc由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定。根據(jù)一個實施方案，穩(wěn)定劑選自：聚磷酸鹽、磷酸化的氨基酸、有機酸、磷酸化、膦酸化、硫酸化或磺化的有機化合物、羥基羧酸的磷酸酯或硫酸酯、二膦酸鹽、糖類和其衍生物、蛋白、磷酸化的蛋白、天然和合成的生物聚合物及其衍生物、以及它們的任意組合。

9、本技術提供如下內(nèi)容：

10、1.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無定形碳酸鈣(acc)，用于在治療選自肌營養(yǎng)不良癥和軸突缺陷的疾病或狀況中使用。

11、2.如項目1所述的藥物組合物，其中所述肌營養(yǎng)不良癥選自杜氏肌營養(yǎng)不良癥、貝克肌營養(yǎng)不良癥、肢帶型肌營養(yǎng)不良癥、先天性肌營養(yǎng)不良癥、面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥、強直性肌營養(yǎng)不良癥、眼咽型肌營養(yǎng)不良癥、遠端型肌營養(yǎng)不良癥和emery-dreifuss肌營養(yǎng)不良癥。

12、3.如項目2所述的藥物組合物，其中所述肌營養(yǎng)不良癥是杜氏肌營養(yǎng)不良癥(dmd)。

13、4.如項目1所述的藥物組合物，其中所述軸突缺陷是軸突損害。

14、5.如項目4所述的藥物組合物，其中治療軸突損害包括促進受損神經(jīng)的再生。

15、6.如項目1、4和5中任一項所述的藥物組合物，其中所述缺陷或損害是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)或外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)的缺陷或損害。

16、7.如項目1至6中任一項所述的藥物組合物，其中所述至少一種穩(wěn)定劑選自：聚磷酸鹽、磷酸化的氨基酸、有機酸、磷酸化、膦酸化、硫酸化或磺化的有機化合物、羥基羧酸的磷酸酯或硫酸酯、二膦酸鹽、糖類及其衍生物、蛋白、肽、磷酸化的蛋白、磷酸化的肽、天然和合成的生物聚合物及其衍生物、以及它們的任意組合。

17、8.如項目7所述的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑選自磷酸絲氨酸、三磷酸鹽、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、植酸、檸檬酸、依替膦酸、焦磷酸鹽、乙醇、六偏磷酸鹽、幾丁質以及它們的任意組合。

18、9.如項目1至8中任一項所述的藥物組合物，其中所述組合物通過全身施用被施用。

19、10.如項目9所述的藥物組合物，其中所述組合物被口服施用。

20、11.如項目9或10所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物被配制成選自片劑、膠囊、丸劑、粉末或顆粒的固體劑型；或選自酏劑、酊劑、懸浮液、糖漿、乳劑、膠體或凝膠的液體或半液體劑型。

21、12.如項目1和4至8中任一項所述的藥物組合物，其中所述疾病或狀況是軸突缺陷，并且所述藥物組合物被局部施用。

22、13.如項目12所述的藥物組合物，其中所述acc在缺陷的或損傷的神經(jīng)附近被施用。

23、14.如項目12或13所述的藥物組合物，其中所述施用通過注射、輸注或通過泵進行。

24、15.如項目12至14中任一項所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物被配制為選自懸浮液、乳劑、膠體或凝膠的液體或半液體劑型。

25、16.如項目1至15中任一項所述的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定的acc的一次顆粒的平均直徑為約10nm至約500nm。

26、17.一種用于體外受精的方法，包括(a)使哺乳動物卵母細胞體外受精；以及(b)體外培養(yǎng)胚胎，其中步驟(a)、步驟(b)或步驟(a)和(b)兩者在包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc的細胞培養(yǎng)基中進行。

27、18.如項目17所述的方法，包括在包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc的細胞培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)所述胚胎，從而促進胚胎發(fā)育。

28、19.如項目17或18所述的方法，進一步包括在步驟(a)之前，在包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc的細胞培養(yǎng)基中卵母細胞的體外成熟的步驟。

29、20.一種用于改進精子質量的方法，包括將精子暴露于由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無定形碳酸鈣(acc)。

30、21.如項目20所述的方法，其中改進精子質量選自由以下組成的組：促進精子運動性、促進精子前向運動性、增加精子計數(shù)以及它們的任意組合。

31、22.如項目21所述的方法，其中增加精子計數(shù)包括在進行運動性或前向運動性程序后增加精子計數(shù)。

32、23.一種用于分離攜帶x染色體和y染色體的精子的方法，包括：(a)使精子樣品與由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc接觸，(b)進行上游程序，(c)獲得包含活動精子的級分，以及(d)分離步驟(c)中獲得的級分的上相和下相，其中所述上相富集有攜帶y染色體的精子，并且所述下相富集有攜帶x染色體的精子。

33、24.如項目17至23中任一項所述的方法，其中所述精子、卵母細胞或胚胎是人或非人哺乳動物的精子、卵母細胞或胚胎。

34、25.如項目24所述的方法，其中所述非人哺乳動物選自由家畜動物、家養(yǎng)寵物、嚙齒類動物和靈長類動物組成的組。

35、26.如項目24所述的方法，其中所述精子、卵母細胞或胚胎是人精子、卵母細胞或胚胎。

36、27.如項目17至26中任一項所述的方法，其中所述至少一種穩(wěn)定劑選自：聚磷酸鹽、磷酸化的氨基酸、有機酸、磷酸化、膦酸化、硫酸化或磺化的有機化合物、羥基羧酸的磷酸酯或硫酸酯、二膦酸鹽、糖類及其衍生物、蛋白、肽、磷酸化的蛋白、磷酸化的肽、天然和合成的生物聚合物及其衍生物、以及它們的任意組合。

37、28.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無定形碳酸鈣(acc)，用于在治療雄性不育中使用。

38、29.如項目28所述的藥物組合物，其中所述雄性不育選自由低精子計數(shù)、低精子運動性和低精子前向運動性造成的雄性不育。

39、30.一種用于在有相應需要的受試者中治療選自肌營養(yǎng)不良癥和軸突缺陷的疾病或狀況的方法，包括向所述受試者施用包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無定形碳酸鈣(acc)的藥學上可接受的組合物。

40、31.如項目30所述的方法，其中所述肌營養(yǎng)不良癥選自由以下組成的組：杜氏肌營養(yǎng)不良癥、貝克肌營養(yǎng)不良癥、肢帶型肌營養(yǎng)不良癥、先天性肌營養(yǎng)不良癥、面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥、強直性肌營養(yǎng)不良癥、眼咽型肌營養(yǎng)不良癥、遠端型肌營養(yǎng)不良癥和emery-dreifuss肌營養(yǎng)不良癥，或其中所述軸突缺陷是軸突損害。

41、32.一種用于在有相應需要的受試者中治療雄性不育的方法，包括向所述受試者向所述受試者施用包含有效量的由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無定形碳酸鈣(acc)的藥物組合物。

42、33.如項目32所述的方法，其中所述雄性不育選自由以下組成的組：與低精子計數(shù)相關的雄性不育、與低精子運動性相關的雄性不育和與低精子前向運動性相關的雄性不育。

43、34.如項目30或33所述的方法，其中所述穩(wěn)定劑選自由以下組成的組：聚磷酸鹽、磷酸化的氨基酸、有機酸、磷酸化、膦酸化、硫酸化或磺化的有機化合物、羥基羧酸的磷酸酯或硫酸酯、二膦酸鹽、糖類及其衍生物、蛋白、磷酸化的蛋白、天然和合成的生物聚合物及其衍生物、以及它們的任意組合。

44、35.一種用于促進細胞生長的方法，包括將細胞暴露于由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc。