本技術(shù)涉及生物制藥，具體涉及含有臍帶間充質(zhì)干細胞的產(chǎn)品、其培養(yǎng)篩選方法以及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、間充質(zhì)干細胞(mscs)是多能干細胞。間充質(zhì)干細胞除了具有自我更新能力和多向分化能力外，還具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗t、b、nk細胞及巨噬細胞等免疫細胞增殖的功能。這些獨特的免疫調(diào)節(jié)特性使間充質(zhì)干細胞成為治療自身免疫性疾病的熱點，如移植物抗宿主病、克羅恩病、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥等，都顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。

2、間充質(zhì)干細胞對先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用主要依賴于間充質(zhì)干細胞的旁分泌能力，這可以通過分泌高水平的可溶性因子來實現(xiàn)。因此，間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)作用非常依賴于這些細胞在給藥后成功遷移到所需組織。不幸的是，間充質(zhì)干細胞的歸巢是低效的，只有一小部分細胞在系統(tǒng)管理后到達目標(biāo)組織。大多數(shù)間充質(zhì)干細胞在外周靜脈移植后被發(fā)現(xiàn)被困在肺部。這可以歸因于毛細血管系統(tǒng)的機械阻抗。這種損耗是實現(xiàn)基于間充質(zhì)干細胞療法的全部治療潛力的一個主要瓶頸。

3、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic?lupus?erythematosus，sle)是一種嚴(yán)重影響人類健康的自身免疫疾病，會導(dǎo)致患者免疫失調(diào)、多器官衰竭，有30％的難治性患者無藥可治，兩年死亡率高達35％。目前全世界大約有420萬患者，其中中國目前約有120萬患者，且近年發(fā)病率逐年上升。狼瘡性腎炎(lupusnephritis，ln)是其中最常見的并發(fā)癥之一，40％～60％的sle患者起病初即有l(wèi)n，目前臨床常規(guī)性療法呈現(xiàn)療效不佳、毒副作用大導(dǎo)致患者難以耐受的困境。與沒有累及腎臟的患者相比，ln患者預(yù)后更差。在我國sle患者中，腎臟受累是僅次于感染的第二位死亡原因。ln也是我國最常見的繼發(fā)性腎小球疾病和導(dǎo)致終末期腎病(esrd)的重要原因之一。約20％的患者在明確診斷10年后進展為esrd，為公共衛(wèi)生帶來了巨大負(fù)擔(dān)。除sle全身表現(xiàn)外，臨床主要表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、腎功能不全等。尿蛋白/肌酐算是判斷腎臟功能的金指標(biāo)，尿蛋白/肌酐越高，表明腎臟功能越差。

4、系統(tǒng)性硬化癥(systemicsclerosis，ssc)又稱硬皮病，是一種以皮膚、血管和內(nèi)臟器官(包括心、肺、腎和胃腸道等)纖維化為特征的結(jié)締組織病。臨床上分為兩個主要亞型：局限皮膚型ssc(cutaneous?limited?ssc，lcssc)與彌漫皮膚型ssc(cutaneous?diffusessc，dcssc)。局限皮膚型ssc皮膚纖維化局限于手指、手和面部。彌漫皮膚型ssc皮膚彌漫性硬化，通常始于手指和手，漸延及前臂、上肢、面部、軀干及下肢。ssc嚴(yán)重程度和發(fā)展情況異質(zhì)性較大，常伴隨多種器官嚴(yán)重受累，后期5年的致死率高達50％以上。

5、ssc發(fā)病率為1～2/10萬，患病率僅次于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid?arthritis，ra)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡，位居結(jié)締組織疾病的第3位。臨床上主要為30～50歲的患者，女性是男性的3～4倍。盡管ssc發(fā)病和致死率很高，但目前尚未建立有效的治療方法，現(xiàn)有的藥物治療在逆轉(zhuǎn)和阻止疾病進展方面基本無效。臨床通常只能對患者進行對癥治療，以減輕疼痛或改善器官功能。在起病3-5年關(guān)鍵期內(nèi)，現(xiàn)有藥物無法阻止疾病進展至重要臟器，而且可能誘發(fā)各種累及臟器的不良反應(yīng)，成為導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一。因此，紓解ssc患者的用藥困境，確保生命安全已經(jīng)迫在眉睫。

6、間充質(zhì)干細胞(mesenchymal?stem?cells，mscs)作為能夠自我更新、增殖、多向分化且能夠發(fā)揮免疫調(diào)控作用的一類細胞，具有突出的免疫調(diào)控能力和良好的安全性，在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制、促血管生成、抗炎、抗纖維化等特性，mscs已在多種自身免疫性疾病的治療實踐中顯示出安全有效。mscs已被應(yīng)用于多種自身免疫性疾病的治療，如治療sle、ra、干燥綜合征(sjogren?syndrome，ss)及炎癥性腸病(inflammatorybowel?disease，ibd)，且未見不良反應(yīng)的報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述存在的技術(shù)局限性，本技術(shù)提出了含有臍帶間充質(zhì)干細胞的產(chǎn)品、其培養(yǎng)篩選方法以及應(yīng)用；其克服了背景技術(shù)中提到的不足和缺陷。

2、為實現(xiàn)上述目的，本技術(shù)采用了以下技術(shù)方案：

3、本技術(shù)的第一個發(fā)明點是提供了一種用于治療免疫性疾病及免疫性相關(guān)疾病的生物制品，所述生物制品包括：細胞表面含有標(biāo)志物的臍帶間充質(zhì)干細胞，所述標(biāo)志物包括slc3a2和/或clic4，且優(yōu)選任意一種標(biāo)志物的表達量均不小于90％。

4、可選地，上述的生物制品，所述免疫性疾病為自體免疫性疾病；優(yōu)選為紅斑狼瘡和/或結(jié)締組織疾病；所述免疫性相關(guān)疾病為狼瘡相關(guān)疾病和/或結(jié)締組織相關(guān)疾病；優(yōu)選為狼瘡腎炎和/或系統(tǒng)性硬化癥。

5、本技術(shù)的第二個發(fā)明點是提供了一種用于治療免疫性疾病及免疫性相關(guān)疾病的生物制品，所述生物制品為含有細胞表面標(biāo)志物和細胞因子受體的臍帶間充質(zhì)干細胞，所述細胞表面標(biāo)志物包括slc3a2和/或clic4，所述細胞因子受體包括cxcr3和/或il4i1；

6、且優(yōu)選地，以上任意一種表面標(biāo)志物的表達量均不小于90％；任意一種細胞因子受體的含量均不小于40％。

7、可選地，上述的生物制品，所述免疫性疾病為自體免疫性疾?。粌?yōu)選為紅斑狼瘡和/或結(jié)締組織疾?。凰雒庖咝韵嚓P(guān)疾病為狼瘡相關(guān)疾病和/或結(jié)締組織相關(guān)疾??；優(yōu)選為狼瘡腎炎和/或系統(tǒng)性硬化癥。

8、本技術(shù)的第三個發(fā)明點是提供了一種上述的生物制品的培養(yǎng)及篩選方法，臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)過程中，當(dāng)匯合度達到50-90％時進行換液培養(yǎng)，培養(yǎng)12-30小時后進行收獲，再以表面標(biāo)志物slc3a2和/或clic4的表達量不小于90％為標(biāo)準(zhǔn)進行篩選。

9、可選地，上述的生物制品的培養(yǎng)及篩選方法，所述換液培養(yǎng)過程中所換的培養(yǎng)液，為加入質(zhì)量體積比1％-5％血清替代物的dmem培養(yǎng)液；所述血清替代物優(yōu)選為人血小板裂解物hpl。

10、本技術(shù)的第四個發(fā)明點是提供了一種上述的生物制品的培養(yǎng)及篩選方法，臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)過程中，當(dāng)匯合度達到50-90％時進行換液培養(yǎng)，培養(yǎng)12-30小時后進行收獲，再以表面標(biāo)志物slc3a2和/或clic4的表達量不小于90％、以及細胞因子受體cxcr3和/或il4i1的含量不小于40％為標(biāo)準(zhǔn)進行篩選。

11、可選地，上述的生物制品的培養(yǎng)及篩選方法，所述換液培養(yǎng)過程中所換的培養(yǎng)液，為加入質(zhì)量體積比1％-5％血清替代物的dmem培養(yǎng)液；所述血清替代物優(yōu)選為人血小板裂解物hpl。

12、本技術(shù)的第五個發(fā)明點是提供了上述的生物制品或通過尚述的方法獲得的所述生物制品在制備用于治療免疫性疾病及免疫性相關(guān)疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述臍帶間充質(zhì)干細胞為培養(yǎng)后篩選得到的細胞表面標(biāo)志物表達量不小于90％的臍帶間充質(zhì)干細胞，所述表面標(biāo)志物包括slc3a2和/或clic4。

13、本技術(shù)的第六個發(fā)明點是提供了上述的生物制品或通過尚述的方法獲得的所述生物制品在制備用于治療免疫性疾病及免疫性相關(guān)疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述臍帶間充質(zhì)干細胞為培養(yǎng)后篩選得到的細胞表面標(biāo)志物表達量不小于90％的、以及細胞因子受體的含量不小于40％的臍帶間充質(zhì)干細胞；所述表面標(biāo)志物包括slc3a2和/或clic4，所述細胞因子受體為cxcr3和/或il4i1。

14、與現(xiàn)有技術(shù)相對比，本技術(shù)具有以下優(yōu)點：

15、本技術(shù)提供了含有臍帶間充質(zhì)干細胞的產(chǎn)品、其培養(yǎng)篩選方法以及應(yīng)用，具體地：

16、本技術(shù)中，生物制品為含有特定種類和表達量的細胞因子的臍帶間充質(zhì)干細胞，或者為含有特定種類和表達量的細胞因子以及含有特定種類和表達量的細胞因子受體，該生物制品對免疫性疾病及免疫性相關(guān)疾病具有極佳的治療作用，尤其是其對狼瘡腎炎和硬皮病等的治療作用效果極其明顯的高于含有其他類型臍帶間充質(zhì)干細胞的生物制品?；谝陨霞夹g(shù)優(yōu)勢，本技術(shù)的生物制品具有極大的市場應(yīng)用和推廣前景。

17、本技術(shù)是針對狼瘡腎炎和/或系統(tǒng)性硬化癥的治療藥物應(yīng)用。為保證自身免疫疾病相關(guān)細胞因子的高效表達，本技術(shù)進行了巧妙的換液制備工藝。本技術(shù)結(jié)合單細胞測序qpcr及流式等多種手段，篩選出對于狼瘡性腎炎和/或系統(tǒng)性硬化癥有作用的臍帶間充質(zhì)干細胞，此類臍帶間充質(zhì)干細胞分泌治療狼瘡性腎炎和/或系統(tǒng)性硬化癥的相關(guān)細胞因子，為狼瘡性腎炎和/或系統(tǒng)性硬化癥的臨床研究提供理論依據(jù)，同時通過細胞因子cxcl10和細胞因子受體cxcr3的關(guān)聯(lián)性研究，確定了用于治療狼瘡性腎炎和/或系統(tǒng)性硬化癥的臍帶間充質(zhì)干細胞制備方向。