本發(fā)明涉及化學(xué)工程和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合型可注射水凝膠及其制備和應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：

1、水凝膠（hydrogel）是以水為分散介質(zhì)的高分子網(wǎng)絡(luò)體系，可以吸收大量水分，并保持一定的形狀。水凝膠性質(zhì)柔軟，彈性模量接近人體的軟組織器官，在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價(jià)值。原位可注射水凝膠是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新型水凝膠體系，利用水凝膠體系的流動(dòng)性，通過(guò)注射的方法將高分子材料植入體內(nèi)，手術(shù)創(chuàng)傷非常微小，還容易滿足布滿不規(guī)則創(chuàng)傷面對(duì)材料的要求，在組織器官缺損修復(fù)中發(fā)揮出越來(lái)越大的作用。

2、聚n-異丙基丙烯酰胺（p(nipam)）水凝膠具有溫敏性特性，當(dāng)溫度低于其較低臨界溶解溫度（lcst）32℃時(shí)，在水中形成良好的水化狀態(tài)，當(dāng)溫度達(dá)到32℃時(shí)呈收縮狀態(tài)。但現(xiàn)有的p(nipam)水凝膠，普遍存在透明性差、彈性差、溫度響應(yīng)性差、機(jī)械強(qiáng)度低、適用面窄等特點(diǎn)，限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

3、本發(fā)明開(kāi)發(fā)一種復(fù)合型可注射水凝膠，以n異丙基丙烯酰胺（nipam)）單體為基本原料，通過(guò)在聚合反應(yīng)中引入巰基（-sh）和不飽和烯鍵（c=c），形成預(yù)聚物一p(nipam-cys)和預(yù)聚物二p(nipam-cys-vinyl)。p(nipam-cys)與p(nipam-cys-vinyl)溶液在常溫下與生物活性物質(zhì)（如細(xì)胞、細(xì)胞外泌體、脫細(xì)胞基質(zhì)材料、生長(zhǎng)因子、藥物）復(fù)合，32℃～37℃環(huán)境下通過(guò)硫醇-烯鍵共價(jià)反應(yīng)，快速形成溫敏型高強(qiáng)度可注射水凝膠。這種溫敏型高強(qiáng)度可注射水凝膠在生物材料、藥物控釋、生化分離、化學(xué)傳感器等方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景，尤其在一些組織器官，如軟骨、骨、脊柱、牙、韌帶、神經(jīng)、血管、肝臟、心臟、腎臟、胰臟、肺臟，的制造與修復(fù)，及傷口止血、糖尿病足愈合、防手術(shù)粘連、動(dòng)脈瘤栓塞，等制劑的制造與應(yīng)用中具有非常突出的優(yōu)勢(shì)和效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種復(fù)合型可注射水凝膠及其制備和應(yīng)用方法。本發(fā)明制備的復(fù)合型可注射水凝膠成膠速度快、機(jī)械強(qiáng)度高、生物活性物質(zhì)與藥物承載量大、生物相容性好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、使用范圍廣，可用作止血材料、傷口敷料、動(dòng)脈瘤栓塞劑、靶向生物活性物質(zhì)（如細(xì)胞、細(xì)胞外泌體、脫細(xì)胞基質(zhì)材料、生長(zhǎng)因子、藥物）遞送載體（如納米載藥系統(tǒng)）和組織器官制造與修復(fù)材料。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案。

3、本發(fā)明公開(kāi)了一種復(fù)合型可注射水凝膠，其特征在于，所述水凝膠前體主要由預(yù)聚物一p(nipam-cys)溶液、預(yù)聚物二p(nipam-cys-vinyl)溶液、生物活性物質(zhì)（如細(xì)胞、細(xì)胞外泌體、脫細(xì)胞基質(zhì)材料、生長(zhǎng)因子、生物活性小分子）和/或藥物組成。

4、進(jìn)一步地，所述預(yù)聚物一p(nipam-cys)以異丙基丙烯酰胺(nipam)單體為基本原料，通過(guò)在聚合反應(yīng)單體nipam中引入定量的n-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺（nas），增加聚合反應(yīng)中活性基團(tuán)巰基（-sh）的含量形成。

5、進(jìn)一步地，所述預(yù)聚物二p(nipam-cys-vinyl)以預(yù)聚物一p(nipam-cys)為基本原料，在預(yù)聚物一p(nipam-cys)分子中引入二乙烯砜（divinylsulfone），增加聚合反應(yīng)中不飽和鍵的含量形成。

6、進(jìn)一步地，所述復(fù)合型可注射水凝膠還包括生物活性物質(zhì)（如細(xì)胞、細(xì)胞外泌體、脫細(xì)胞基質(zhì)材料、生長(zhǎng)因子、生物活性小分子）和/或藥學(xué)上可接受的藥物。

7、本發(fā)明還公開(kāi)了一種上述任一項(xiàng)所述的復(fù)合型可注射水凝膠的制備方法，其特征在于，包括一下步驟：

8、第一步預(yù)聚物一p(nipam-cys)合成：

9、（1）稱(chēng)取市場(chǎng)上采購(gòu)的異丙基丙烯酰胺(nipam)粉末25g置于500ml三頸瓶中，加入250ml無(wú)水四氫呋喃（thf），nipam溶解后加入定量的n-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺（nas）并攪拌使之溶解，用氮?dú)猓╪2）泡除去反應(yīng)體系中的氧氣（o2），再加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈（aibn），將反應(yīng)體系加熱到65℃，在n2環(huán)境下反應(yīng)24h，得粗放的反應(yīng)產(chǎn)物p(nipam-nas)；將反應(yīng)產(chǎn)物用乙醚沉淀，濾紙過(guò)濾，制得精制的p(nipam-nas)；

10、（2）將市場(chǎng)上采購(gòu)的氯化氫巰基乙胺（cys·hcl）按質(zhì)量百分比2%溶于無(wú)水二氯甲烷（dcm），加入三乙胺（n(et)3），攪拌過(guò)液，形成透明溶液；將步驟（1）制得的精制的p(nipam-nas)以質(zhì)量百分比5%溶于無(wú)水thf，加入上述透明溶液中，室溫n2環(huán)境下反應(yīng)過(guò)夜，再加入二硫代蘇糖醇（dtt）和cys·hcl，縮合反應(yīng)2h，將其中dcm蒸發(fā)掉后用乙醚沉淀產(chǎn)物，濾紙過(guò)濾、蒸餾水透析、真空干燥后得粉末狀預(yù)聚物一p(nipam-cys)；

11、第二步預(yù)聚物二p(nipam-cys-viny)合成：

12、稱(chēng)取10g由步驟一制得的p(nipam-cys)置于500ml三頸瓶中，其中加入100ml無(wú)水dcm，使之溶解，加入2ml無(wú)水thf和二乙烯砜（divinylsulfone），室溫下反應(yīng)16h，得反應(yīng)產(chǎn)物p(nipam-cys-vinyl)；將其中dcm蒸發(fā)掉后用乙醚沉淀反應(yīng)產(chǎn)物、濾紙過(guò)濾、蒸餾水透析、真空干燥后得粉末狀預(yù)聚物二p(nipam-cys-vinyl)；

13、第三步復(fù)合型可注射p(nipam-cys-vinyl-cys)水凝膠的制備：

14、將前兩步合成的預(yù)聚物一p(nipam-cys)和預(yù)聚物二p(nipam-cys-vinyl)分別溶于pbs溶液、dmem細(xì)胞培養(yǎng)液或水中，在室溫下以混合均勻，加入生物活性物質(zhì)（如細(xì)胞、細(xì)胞外泌體、脫細(xì)胞基質(zhì)材料、生長(zhǎng)因子、生物活性小分子）和/或藥物，將體系溫度升高到32℃～37℃，兩種預(yù)聚物自發(fā)聚合在一起，形成含生物活性物質(zhì)的復(fù)合型可注射p(nipam-cys-vinyl-cys)水凝膠。

15、進(jìn)一步地，第一步（1）中所述nas與nipam單體的摩爾比范圍為1%～100%；aibn與nipam單體的質(zhì)量百分比范圍為0.1%～1%；（2）中所述n(et)3與dcm質(zhì)量百分比范圍為1%～10%；dtt與dcm質(zhì)量百分比范圍為1%～10%。

16、進(jìn)一步地，第二步中所述二乙烯砜（divinylsulfone）的用量范圍為預(yù)聚物一p(nipam-cys)摩爾濃度的1%～100%。

17、進(jìn)一步地，第三步中預(yù)聚物一p(nipam-cys)和預(yù)聚物二p(nipam-cys-vinyl)溶液以質(zhì)量百分比9:1～1:9混合均勻。

18、進(jìn)一步地，所述制備方法還包括以下步驟：

19、（1）活細(xì)胞懸液制備：將培養(yǎng)瓶中融合度達(dá)80%以上的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-0.02%edta消化、離心，制得離心沉淀物，將離心沉淀物懸浮于0.5mlpbs溶液或dmem細(xì)胞培養(yǎng)液中，制得活細(xì)胞懸浮液；

20、（2）活細(xì)胞、活性分子、藥物微球制備：將海藻酸鈉粉末溶于pbs溶液，制成質(zhì)量百分比為1%～5%的海藻酸鈉溶液；將細(xì)胞、細(xì)胞外泌體、脫細(xì)胞基質(zhì)材料、生長(zhǎng)因子、生物活性小分子、藥物分別或兩個(gè)以上復(fù)合后加入0.5mlpbs溶液或dmem細(xì)胞培養(yǎng)液中，再以質(zhì)量百分比為0.1%～10%加入海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻，制得含細(xì)胞、細(xì)胞外泌體、脫細(xì)胞基質(zhì)材料、生長(zhǎng)因子、生物活性小分子、藥物的海藻酸鈉混合物，利用注射器將含細(xì)胞、細(xì)胞外泌體、脫細(xì)胞基質(zhì)材料、生長(zhǎng)因子、生物活性小分子、藥物的海藻酸鈉混合物注入京尼平pbs溶液（京尼平濃度為10～100mg/ml）或氯化鈣pbs溶液中（氯化鈣濃度1%～10%w/v），過(guò)濾、收集含細(xì)胞、活性分子、藥物的海藻酸鈉納米微球；

21、（3）活細(xì)胞、細(xì)胞外泌體、脫細(xì)胞基質(zhì)材料、生長(zhǎng)因子、生物活性小分子、藥物與p(nipam-cys-viny-cys)高分子網(wǎng)絡(luò)復(fù)合：將步驟（1）、（2）制得的活細(xì)胞、細(xì)胞外泌體、脫細(xì)胞基質(zhì)材料、生長(zhǎng)因子、生物活性小分子及藥物懸浮液或納米顆粒中的一種或兩種以上復(fù)合物，以質(zhì)量百分比0.01%～20%加入到預(yù)聚物一p(nipam-cys)和聚物二p(nipam-cys-vinyl)的pbs溶液或dmem細(xì)胞培養(yǎng)液中，室溫下攪拌均勻，將體系溫度升高到32℃～37℃，制得含活細(xì)胞、細(xì)胞外泌體、脫細(xì)胞基質(zhì)材料、生長(zhǎng)因子、生物活性小分子及藥物的復(fù)合型可注射水凝膠。

22、與現(xiàn)有技術(shù)比，本發(fā)明的有益效果如下。

23、本發(fā)明以異丙基丙烯酰胺(nipam)單體為基本原料，通過(guò)在聚合反應(yīng)單體nipam中引入定量的n-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺（nas），增加聚合反應(yīng)中活性基團(tuán)巰基（-sh）的含量，形成預(yù)聚物一，p(nipam-cys)。在預(yù)聚物一p(nipam-cys)分子中引入二乙烯砜（vinylsulfone），增加聚合反應(yīng)中不飽和鍵（即烯鍵，vinyl）的含量，形成預(yù)聚物二，p(nipam-cys-vinyl)。將預(yù)聚物一和預(yù)聚物二溶液按比例混合，加入生物活性物質(zhì)，如活細(xì)胞、活性分子和藥物中的至少一種，32℃～37℃下形成復(fù)合型可注射p(nipam-cys-vinyl-cys)水凝膠。本發(fā)明制備的復(fù)合型可注射水凝膠成膠速度快、機(jī)械強(qiáng)度高、生物活性物質(zhì)與藥物承載量大、生物相容性好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、使用范圍廣，可用作止血材料、傷口敷料、動(dòng)脈瘤栓塞劑、靶向生物活性物質(zhì)與藥物遞送載體（如納米載細(xì)胞與藥物系統(tǒng)）和組織器官制造與修復(fù)材料。