本發(fā)明涉及疫苗佐劑，尤其涉及一種新型兩親性tlr9類佐劑及其制備方法與在mrna疫苗中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、mrna技術(shù)本身的免疫優(yōu)勢(shì)和簡(jiǎn)化的合成生產(chǎn)工藝，使得其在疫苗的研發(fā)生產(chǎn)中具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。mrna疫苗作為一種既可以預(yù)防又可以用于治療的技術(shù)形式，目前在腫瘤、病毒、遺傳性疾病以及基因編輯治療等領(lǐng)域均有應(yīng)用。mrna疫苗可進(jìn)入胞質(zhì)后翻譯特定蛋白，引發(fā)特異性抗原的免疫應(yīng)答，可以更高程度地激活體液免疫和細(xì)胞免疫。

2、細(xì)胞免疫激活水平與宿主對(duì)病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的直接和間接殺傷能力有密切關(guān)系。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，制備針對(duì)新冠病毒的mrna疫苗，經(jīng)過二次免疫，小鼠的脾臟細(xì)胞再次暴露抗原后產(chǎn)生的ifn-γ+cd8+t細(xì)胞比例無顯著增加，且分泌的細(xì)胞因子如ifn-γ的水平也較低。一項(xiàng)正在進(jìn)行i期臨床試驗(yàn)的腫瘤mrna疫苗，僅有50％的患者經(jīng)免疫后可產(chǎn)生抗原特異性cd8+t細(xì)胞。如何使mrna疫苗獲得有效的細(xì)胞免疫激活能力滿足預(yù)防或治療性需求，是目前mrna疫苗開發(fā)的重要部分。

3、細(xì)胞免疫激活的關(guān)鍵之一在于t細(xì)胞激活的水平。t細(xì)胞與成熟dcs作用活化后可增殖分化為效應(yīng)t細(xì)胞。主要包括cd8陽性的細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctls)，和cd4陽性的輔助t細(xì)胞。t細(xì)胞活化需要同時(shí)激活多種信號(hào)，第一信號(hào)為dcs對(duì)特異性抗原進(jìn)行加工處理，并呈遞在細(xì)胞表面的mhc復(fù)合物，mhc/抗原肽-tcr作為t細(xì)胞活化的第一信號(hào)。第二信號(hào)為經(jīng)抗原刺激后成熟dcs表達(dá)的cd80、cd86、cd40等共刺激分子的刺激作用。同時(shí)，成熟的dcs分泌多種細(xì)胞因子包括il-6和il-12等，二者可以輔助刺激t細(xì)胞成熟和分化，提高細(xì)胞免疫激活水平。綜上所述，樹突狀細(xì)胞(dcs)的高效抗原呈遞以及活化水平是激活宿主體內(nèi)t細(xì)胞應(yīng)答的重要部分，也是mrna疫苗高效發(fā)揮激活機(jī)體免疫能力的先決條件。

4、免疫的強(qiáng)度很大程度上取決于對(duì)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的激活能力。作為固有性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之間的重要橋梁—樹突狀細(xì)胞(dcs)需要足夠的先天免疫應(yīng)答信號(hào)來識(shí)別抗原并遞呈以調(diào)控特異性免疫水平的活化。dcs的成熟程度與抗原蛋白刺激程度高度相關(guān)，當(dāng)抗原刺激dcs后，細(xì)胞表面將高表達(dá)共刺激分子如cd80、cd86等，這將激活幼稚t細(xì)胞。合適的佐劑與抗原共遞送可以顯著上調(diào)cd80和cd86等共刺激分子的表達(dá)以及細(xì)胞因子的分泌，是促進(jìn)dcs成熟的有效手段。因此，佐劑與mrna疫苗共遞送是增強(qiáng)mrna疫苗免疫效果的有效策略之一。

5、mrna疫苗目前存在自佐劑效應(yīng)，但誘發(fā)免疫應(yīng)答水平較低且直接添加佐劑會(huì)干擾mrna穩(wěn)定性，如傳統(tǒng)的鋁鹽佐劑、乳劑型佐劑mf59、as03等佐劑在增強(qiáng)固有免疫的同時(shí)，誘導(dǎo)的i型干擾素反應(yīng)容易導(dǎo)致mrna降解，使mrna疫苗的免疫原性受限。而toll樣受體激動(dòng)劑9(tlr9)類佐劑可以改善該種情況，已有研究報(bào)道該佐劑成功應(yīng)用于mrna疫苗的案例。在該案例中，將rbd?mrna以及cpg共同封裝進(jìn)可轉(zhuǎn)變電性的載體中，可誘導(dǎo)更廣泛的免疫應(yīng)答，提高了mrna疫苗用于免疫治療的有效性。然而，如果直接將未修飾的cpg與mrna@lnp物理混合孵育，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)體逃逸效率較低、抗原蛋白表達(dá)不足等問題，這均會(huì)影響mrna疫苗發(fā)揮免疫效用。

6、cpg寡核苷酸佐劑是由dynavax研發(fā)，其作用機(jī)理明確、特異性高、安全性良好。但是，由于自身是寡核苷酸分子，該結(jié)構(gòu)容易被體內(nèi)的核酸酶降解。為避免降解，有研究者設(shè)計(jì)具有硫代磷酸化骨架的新型b類cpg，從而增強(qiáng)dna酶抗性。然而在多項(xiàng)研究包括臨床研究中提示該骨架的cpg佐劑存在一定肝腎毒性，并可能通過擴(kuò)散進(jìn)入血液而增加全身毒性。其次，cpg作為寡核苷酸分子不易通過質(zhì)膜，而佐劑有效進(jìn)入靶細(xì)胞是準(zhǔn)確起效的關(guān)鍵。硫代磷酸化骨架的cpg佐劑并沒有改變自身帶負(fù)電的性質(zhì)，細(xì)胞攝取效率并未改善。因此，如何增加cpg佐劑的核酸酶抗性、有效提升佐劑與mrna疫苗聯(lián)用后進(jìn)入靶細(xì)胞的量，仍然我們亟需解決的關(guān)鍵問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，第一方面，本發(fā)明提供了一種新型兩親性tlr9類佐劑，與mrna疫苗連用可以產(chǎn)生激活體液免疫及t細(xì)胞免疫雙重機(jī)制。

2、本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案如下：

3、一種新型兩親性tlr9類佐劑，所述兩親性tlr9類佐劑為在含有特定序列的cpgodns的3’端共價(jià)連接有脂質(zhì)材料的佐劑；所述脂質(zhì)材料選自陽離子脂質(zhì)、中性輔助脂質(zhì)、膽固醇、peg修飾的脂質(zhì)中的一種或多種。

4、作為優(yōu)選，所述含有特定序列的cpg?odns包括a型cpg?odns、b型cpg?odns、c型cpgodns；所述a型cpg-odns，以含有cpg二核苷酸的回文序列為核心，兩端為poly?g尾，磷酸二酯鍵骨架為部分硫代修飾；所述b型cpg-odns，全部硫代修飾的骨架，含有1個(gè)或多個(gè)cpg基序，沒有poly?g尾，不形成典型的高級(jí)結(jié)構(gòu)；所述c型cpg-odns是一類全硫代修飾的cpg-odns,能夠通過3’端的回文序列形成二聚體。

5、作為優(yōu)選，所述陽離子脂質(zhì)包括dotap、dotma、sm-102、alc-0315、dlin-mc3-dma等；所述中性輔助脂質(zhì)包括dspe、dope、dppe、dmpe、dmg-peg2000、固醇類脂質(zhì)。

6、作為優(yōu)選，所述共價(jià)連接包括通過羧基、羥基、氨基進(jìn)行的共價(jià)結(jié)合。

7、作為優(yōu)選，所述新型兩親性tlr9類佐劑為在含有特定序列的cpg?odns的3’端連接c6-nh2基團(tuán)共價(jià)連接修飾有nhs基團(tuán)的中性輔助脂質(zhì)。

8、進(jìn)一步優(yōu)選，所述中性輔助脂質(zhì)包括dspe(1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺)、dope(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dppe(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)。

9、作為優(yōu)選，所述新型兩親性tlr9類佐劑具有淋巴結(jié)靶向。

10、cpg佐劑等短鏈核酸結(jié)構(gòu)與疏水性分子共價(jià)連接后，同時(shí)具有親水性和親脂性的特點(diǎn)，即為“兩親性”，可進(jìn)一步提升cpg佐劑對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性，改善藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。cpg佐劑與疏水分子的共價(jià)連接也可有效解決其細(xì)胞攝取效率低的問題，二者共價(jià)結(jié)合后，分子整體脂溶性增加，由于相似相溶原理可以和lnp外側(cè)脂質(zhì)層存在相互作用形成一個(gè)整體，增加巨噬細(xì)胞和淋巴結(jié)樹突狀細(xì)胞(dcs)對(duì)抗原的攝取。巨噬細(xì)胞是先天免疫激活的重要組成部分，其中m1型巨噬細(xì)胞能分泌大量細(xì)胞因子，發(fā)揮抗原遞呈功能，具有清除病原微生物和抗腫瘤作用。dcs是最強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞(apc)，也是唯一能激活初始t細(xì)胞的apc，其在誘導(dǎo)cd8+t細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答中至關(guān)重要。

11、dspe是一種mrna疫苗中常用的疏水脂質(zhì)材料，本發(fā)明擬選用dspe作為親脂性尾部結(jié)構(gòu)修飾cpg，設(shè)計(jì)cpg新型遞送形式。聚合物dspe-peg具有良好體內(nèi)安全性，它與體內(nèi)進(jìn)行脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)陌椎鞍拙哂休^高的親和性；同時(shí)，dspe-peg還被報(bào)道可以自發(fā)地從白蛋白中轉(zhuǎn)移嵌入細(xì)胞膜的磷脂雙分子層中，可利用白蛋白內(nèi)在的淋巴結(jié)回流機(jī)制，實(shí)現(xiàn)mrna和佐劑淋巴結(jié)的靶向。淋巴結(jié)是抗原提呈發(fā)生的主要場(chǎng)所，并且定居的抗原提呈細(xì)胞都是未成熟的表型，具備較強(qiáng)的抗原攝取能力。設(shè)計(jì)淋巴結(jié)靶向可以有效富集抗原呈遞，導(dǎo)致全面的局部免疫激活，同時(shí)上調(diào)免疫細(xì)胞mhc?i和mhc?ii分子和協(xié)同共刺激分子的表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，提升細(xì)胞免疫的同時(shí)還能促進(jìn)cd4+t細(xì)胞向th1細(xì)胞分化。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)包括既增加mrna疫苗的細(xì)胞攝取和內(nèi)體逃逸效率，又可延長(zhǎng)佐劑在淋巴結(jié)中的滯留時(shí)間，利于刺激機(jī)體的免疫反應(yīng)。

12、第二方面，本發(fā)明提供了上述新型兩親性tlr9類佐劑的制備方法：將所述含有特定序列的cpg?odns溶于碳酸鹽中混勻后，加入溶解的所述脂質(zhì)材料，反應(yīng)11～20h，得到新型兩親性tlr9類佐劑。

13、本發(fā)明還提供了新型兩親性tlr9類佐劑，在聯(lián)合mrna疫苗高效激活體內(nèi)細(xì)胞免疫和體液免疫，特別是th1介導(dǎo)免疫應(yīng)答能力中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明還提供了一種遞送載體，其包含上述的新型兩親性tlr9類佐劑。

15、第三方面，本發(fā)明還提供了上述新型兩親性tlr9類佐劑在制備mrna疫苗中的應(yīng)用。

16、第四方面，本發(fā)明還提供了一種mrna疫苗，其包括上述所述的新型兩親性tlr9類佐劑、脂質(zhì)納米顆粒mrna@lnp；所述脂質(zhì)納米顆粒mrna@lnp包括抗原mrna和脂質(zhì)材料；所述脂質(zhì)材料選自陽離子脂質(zhì)、中性輔助脂質(zhì)、膽固醇、peg修飾的脂質(zhì)中的一種或多種。

17、作為優(yōu)選，所述抗原mrna包括病毒或腫瘤特異性抗原mrna。此時(shí)，與新型兩親性tlr9類佐劑聯(lián)合的mrna疫苗，高效誘導(dǎo)機(jī)體針對(duì)特定病毒或腫瘤的細(xì)胞免疫和體液免疫，尤其是th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答能力。所述誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答包括產(chǎn)生了針對(duì)目標(biāo)病毒或腫瘤的保護(hù)性抗體。

18、第五方面，本發(fā)明提供了所述的mrna疫苗的制備方法，包括以下步驟：

19、s1、將上述含有特定序列的cpg?odns溶于碳酸鹽中混勻后，加入溶解的所述脂質(zhì)材料，反應(yīng)11～20h，得到新型兩親性tlr9類佐劑，純化；

20、s2、制備所述脂質(zhì)納米顆粒mrna@lnp；

21、s3、將所述脂質(zhì)納米顆粒mrna@lnp與所述新型兩親性tlr9類佐劑在2～6℃共同孵育，得到mrna疫苗。

22、本發(fā)明通過添加dspe-cpg與lnp共孵育，既可以增加lnp的外側(cè)脂質(zhì)層厚度以提高對(duì)mrna的保護(hù)效率，又增加lnp的內(nèi)體逃逸效率和抗原蛋白表達(dá)水平。同時(shí)，將cpg佐劑與抗原共遞送進(jìn)同一抗原提呈細(xì)胞內(nèi)，增加mrna疫苗的細(xì)胞免疫能力。

23、作為優(yōu)選，所述含有特定序列的cpg?odns包括：

24、cpg?1018，序列：5’-tgactgtgaacgttcgagatga-3’；

25、cpg?1826，序列：5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’；

26、cpg?2216，序列：5’-gggggacga:tcgtcgggggg-3’；

27、cpg?1585，序列：5’-gspgggtcaacgttgaggspgspgspgspg-3’；

28、cpg?1826，序列：5’-(p-thio)tccatgacgttcctgacgtt-3’；

29、cpg?5328，序列：5’-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3’；

30、cpg?2336，序列：5’-ggggacgac:gtcgtggggggg-3’。

31、作為優(yōu)選，所述純化方法包括hplc、ultrapage、page、hplc-ce。

32、作為優(yōu)選，將所述脂質(zhì)納米顆粒cpg-mrna@lnp制成冷凍制劑或冷凍干燥制劑。

33、作為優(yōu)選，所述s2中制備所述脂質(zhì)納米顆粒mrna@lnp的方法包括：將抗原mrna分子溶解在枸櫞酸鹽緩沖液水相中，采用微流控方法與溶解在乙醇相中的脂質(zhì)材料混合，制備負(fù)載有mrna的脂質(zhì)納米顆粒，超濾方法除掉乙醇。

34、作為優(yōu)選，去除乙醇方法包括透析法、超濾法等。

35、新型兩親性tlr9類佐劑配合疫苗聯(lián)合使用，給藥方式可以是肌肉注射、皮下給藥、腹腔給藥、靜脈注射以及經(jīng)鼻給藥等多種手段，本發(fā)明中使用肌肉注射方式給藥。

36、本發(fā)明還提供了一種藥物組合，其包括：上述新型兩親性tlr9類佐劑、病毒或腫瘤抗原序列的mrna以及可以承載上述兩種物質(zhì)的藥學(xué)上可接受的載體。

37、作為優(yōu)選，所述病毒或腫瘤抗原的mrna序列的體外合成需完成5’端帽結(jié)構(gòu)、3’端polya尾的添加，其余具體堿基或核糖修飾包括但不限于n6-甲基腺苷(n6-methyl-adenosine，m6a)，5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，m5c)，n1-甲基腺苷(n1-methyladenosine，m1a)，n7-甲基鳥苷(n7-methylguanosine，m7g)，n4-乙酰胞嘧啶(n4-acetylcytosine，ac4c)，假尿苷(ψ)，肌苷(i)和核糖甲基化(2'-o-me)，5-甲氧基-尿苷(5-methoxy-uridine，5mou)等。

38、本發(fā)明還提供了一種涉及調(diào)節(jié)個(gè)體內(nèi)免疫反應(yīng)的方法，其包括向所述個(gè)體施用上述的新型兩親性tlr9類佐劑聯(lián)合的mrna疫苗，其給予的量足以調(diào)節(jié)所述個(gè)體內(nèi)的免疫反應(yīng)。這些個(gè)體包括患有接受疫苗如治療性疫苗或預(yù)防性疫苗的個(gè)體、患癌癥的個(gè)體、患感染性疾病的個(gè)體以及有可能接觸傳染性因子的個(gè)體。

39、本發(fā)明還提供了一種涉及增加個(gè)體內(nèi)ifn-γ的方法，該方法包括將上述的新型兩親性tlr9類佐劑聯(lián)合的mrna疫苗給予該個(gè)體。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物的給予增加了該個(gè)體內(nèi)的ifn-γ。這些個(gè)體包括患有接受疫苗如治療性疫苗或預(yù)防性疫苗的個(gè)體、患癌癥的個(gè)體、患感染性疾病的個(gè)體以及有可能接觸傳染性因子的個(gè)體。

40、本發(fā)明還提供了緩解感染性疾病的一種或多種癥狀的方法，該方法包括將上述的新型兩親性tlr9類佐劑聯(lián)合的mrna疫苗給予患感染性疾病的個(gè)體。本發(fā)明的上述的新型兩親性tlr9類佐劑聯(lián)合的mrna疫苗的給予緩解了該感染性疾病的一種或多種癥狀。

41、本發(fā)明具有以下有益效果：

42、(1)本發(fā)明新型兩親性tlr9類佐劑，將含有特定序列的cpg?odns的3’端共價(jià)連接脂質(zhì)材料，使佐劑同時(shí)具有親水性和親脂性的特點(diǎn)，提升了佐劑對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性，改善藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)；同時(shí)也能有效解決其細(xì)胞攝取效率低的問題，二者共價(jià)連接后，佐劑分子整體脂溶性增加，由于相似相溶原理可以和lnp外側(cè)脂質(zhì)層存在相互作用形成一個(gè)整體，增加巨噬細(xì)胞和淋巴結(jié)樹突狀細(xì)胞(dcs)對(duì)抗原的攝取；可以在相同接種量的條件下更大程度的增強(qiáng)體內(nèi)特異性細(xì)胞免疫的激活能力，發(fā)揮更大的生物學(xué)效應(yīng)；

43、(2)發(fā)明通過添加dspe-cpg與lnp共孵育，既可以增加lnp的外側(cè)脂質(zhì)層厚度以提高對(duì)mrna的保護(hù)效率，又增加lnp的內(nèi)體逃逸效率和抗原蛋白表達(dá)水平；同時(shí)，將cpg佐劑與抗原共遞送進(jìn)同一抗原提呈細(xì)胞內(nèi)，增加mrna疫苗的細(xì)胞免疫能力；

44、(3)本發(fā)明提供的新型兩親性tlr9類佐劑聯(lián)合mrna疫苗可以產(chǎn)生激活體液免疫及t細(xì)胞免疫雙重機(jī)制并且在提升th1免疫應(yīng)答方面有顯著優(yōu)勢(shì)，以對(duì)抗特定病毒或腫瘤。