本發(fā)明屬于化妝品，涉及一種迷迭香發(fā)酵濾液的制備方法和應(yīng)用，尤其涉及一種具有修護(hù)皮膚屏障功效的迷迭香發(fā)酵濾液的制備方法及其在化妝品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、迷迭香是一種天然香料，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗抑郁等多種生物活性，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、香料、醫(yī)藥等領(lǐng)域。當(dāng)前常見的迷迭香精油、純露提取物普遍采用傳統(tǒng)的高溫蒸煮水提、有機(jī)溶劑萃取、超臨界萃取等工藝。例如，專利cn103205314中公開了一種迷迭香提取物的制備方法，該方法使用超臨界co2流體分離出了迷迭香的香氣成分，并進(jìn)一步蒸餾得到了迷迭香提取物。專利cn103966027公開了一種迷迭香復(fù)配提取物的制備方法，將凍干的迷迭香葉莖粉碎后先用乙醇提取，離心后收集迷迭香乙醇提取物，又使用超臨界co2對(duì)離心后的沉淀進(jìn)行萃取得到迭香提取物：最后經(jīng)過(guò)復(fù)配得到了迷迭香復(fù)配提取物。

2、但是上述處理方法不僅會(huì)嚴(yán)重?fù)p害迷迭香的有效活性成分，提取率低，而且會(huì)導(dǎo)致一些有機(jī)溶劑殘留；在光照和加熱等條件下又容易揮發(fā)以及分解變質(zhì)，致使其生物利用度很低，大大限制和削弱了其在化妝品、護(hù)膚品等領(lǐng)域巨大的應(yīng)用潛力。

3、此外，也有部分專利公開了使用生物發(fā)酵的方法對(duì)迷迭香進(jìn)行提取。例如，專利cn107951002使用了豬苓菌的固態(tài)梯度變溫發(fā)酵及生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，提高了提取效率并改善了迷迭香提取物風(fēng)味。但該方法在提取效率、風(fēng)味改善、以及產(chǎn)物的生物活性上仍有改進(jìn)空間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，并提供一種迷迭香發(fā)酵濾液的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的制備方法先選用超低溫對(duì)迷迭香莖葉進(jìn)行快速冷凍，接著通過(guò)高速研磨、超高壓納米均質(zhì)和超濾等手段，得到迷迭香均漿濾液；然后將迷迭香均漿濾液補(bǔ)料泵入微生物發(fā)酵過(guò)程中，利用微生物對(duì)迷迭香進(jìn)行發(fā)酵加工，并且依次經(jīng)過(guò)多次高壓均質(zhì)、超聲破碎、高速離心、過(guò)濾除菌等處理步驟，最終得到迷迭香發(fā)酵濾液。

2、本發(fā)明一方面提供了一種迷迭香發(fā)酵濾液的制備方法，包括以下步驟：

3、s1）將新鮮迷迭香莖葉剪碎后于-180℃至-196℃冷凍10-20min；接著用研磨機(jī)研磨粉碎，所得漿粉過(guò)100目過(guò)濾網(wǎng)/篩網(wǎng)濾出，得到迷迭香細(xì)漿粉；保持研磨處理過(guò)程中溫度始終維持在4℃以下；將所述迷迭香細(xì)漿粉加水稀釋后泵入均質(zhì)機(jī)勻漿得到迷迭香細(xì)漿液；所述迷迭香細(xì)漿液離心后過(guò)濾，得到迷迭香均漿濾液；

4、s2）將微生物菌種接種于培養(yǎng)基中，每隔2個(gè)小時(shí)取樣測(cè)定其在600nm處的吸光值，然后以吸光值為縱坐標(biāo)，生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線；當(dāng)od600為9~12，優(yōu)選為10時(shí)，得到微生物發(fā)酵種子液；所述的微生物菌種為益生菌桿菌或酵母菌中的一種，進(jìn)一步優(yōu)選乳酸桿菌、畢赤酵母、雙歧桿菌、釀酒酵母、巴氏酵母、假絲酵母、深紅酵母或魯氏結(jié)合酵母中的一種；

5、s3）將微生物發(fā)酵種子液轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中，根據(jù)s2所繪生長(zhǎng)曲線培養(yǎng)至微生物對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期中后期后，在2-3?h內(nèi)迷迭香均漿濾液補(bǔ)料添加入微生物發(fā)酵液中，繼續(xù)培養(yǎng)至od600穩(wěn)定為9~12后，優(yōu)選10后，3-4小時(shí)，得到發(fā)酵后的迷迭香發(fā)酵原液；

6、s4）對(duì)發(fā)酵后的迷迭香發(fā)酵原液進(jìn)行高壓勻漿、離心、過(guò)濾或超聲波離心處理。

7、在步驟s1中，進(jìn)一步優(yōu)選將新鮮迷迭香莖葉剪碎成1-2cm小段；在研磨過(guò)程可以利用粉碎研磨產(chǎn)生的熱量，將迷迭香細(xì)漿粉的溫度由冷凍狀態(tài)提升并維持在4℃左右，從而可以逐步復(fù)蘇和維持迷迭香細(xì)漿粉中的多種天然成分活性。

8、在步驟s1中新鮮迷迭香莖葉于超低溫條件下在較短的時(shí)間內(nèi)即可被冷凍，減少了新鮮迷迭香莖葉中多種活性成分的揮發(fā)和破壞；低溫狀態(tài)下粉碎研磨以及高壓納米均質(zhì)，有利于微生物發(fā)酵過(guò)程中對(duì)多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的充分利用。相較于高溫提取，該方法減少了迷迭香莖葉中活性成分高溫蒸煮過(guò)程中的大量散失和破壞。

9、在步驟s2中，接種需在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，且培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行高壓滅菌處理，避免接種過(guò)程中引入其他菌種以及添加額外的其他化學(xué)試劑，從而利于保證迷迭香發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)成分來(lái)源清晰，有據(jù)可查。在步驟s2中繪制生長(zhǎng)曲線，摸索微生物菌種最佳的生長(zhǎng)條件，有利于精確控制微生物發(fā)酵的各項(xiàng)工藝參數(shù)，獲得最大的收益。在一般情況下，od600達(dá)到10所需的培養(yǎng)時(shí)間為1-2天。

10、在步驟s3中，在一般情況下，od600達(dá)到10所需的培養(yǎng)時(shí)間為1-7天，優(yōu)選1-3天，更優(yōu)選1-2天。

11、在步驟s4中，還可根據(jù)化妝品廠商的不同需求，添加活性炭或大孔樹脂除色除臭等步驟。

12、作為優(yōu)選，所述步驟s1中迷迭香細(xì)漿粉加水稀釋的料液比為1?:?5；所述步驟s1中迷迭香細(xì)漿液離心后用0.45微米的濾膜過(guò)濾，離心過(guò)濾過(guò)程中的溫度保持在10℃以下。具體地，使用高壓納米均質(zhì)機(jī)高壓均質(zhì)然后過(guò)0.45微米的濾膜過(guò)濾，可以使迷迭香粉碎更均勻，大大提升胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率，從而實(shí)現(xiàn)微生物充分發(fā)酵，有效提升活性物質(zhì)的產(chǎn)量，且有利于迷迭香多種活性成分的保留；低溫離心后用0.45微米的濾膜過(guò)濾截留了迷迭香原料中攜帶的雜菌，而且有利于接下來(lái)的發(fā)酵過(guò)程的順利進(jìn)行。

13、作為優(yōu)選，所述步驟s1中研磨機(jī)研磨條件為5000?rpm粉碎3-5min，中間間歇時(shí)間3-5min，共粉碎3次；所述步驟s1中均質(zhì)機(jī)為高壓納米均質(zhì)機(jī)，勻漿的條件為30000?psi,100ml/min最大流量；所述步驟s1中離心所用機(jī)器為高速冷凍機(jī)，離心條件為12000?rpm，4℃離心30min。

14、作為優(yōu)選，步驟s2中，所述乳酸桿菌優(yōu)選為中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心植物乳桿菌，保藏號(hào)為cicc?23941；所述雙歧桿菌優(yōu)選為中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心兩歧雙歧桿菌，保藏號(hào)為cicc?10395；所述酵母菌優(yōu)選為中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心釀酒酵母，保藏號(hào)為cicc?1001。

15、作為優(yōu)選，所述步驟s2中培養(yǎng)基與所述微生物菌種的接種量體積比優(yōu)選為100?:(1~5)；

16、所述步驟s2中不同的微生物菌種采用不同的培養(yǎng)條件：

17、當(dāng)微生物菌種為益生桿菌時(shí)，步驟s2中所用培養(yǎng)基為mrs培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為厭氧密封，37℃、200～250rpm，優(yōu)選220rpm搖床震蕩培養(yǎng)；

18、當(dāng)微生物菌種為酵母菌時(shí)，步驟s2中所用培養(yǎng)基為ypd培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為通氣空氣加壓，壓力值為0.05-0.1?mpa，28～32℃、200～250rpm搖床震蕩培養(yǎng)；優(yōu)選30℃，220rpm搖床震蕩培養(yǎng)。需要注意的是需先將發(fā)酵罐做好氣密后，通過(guò)泵入空氣實(shí)時(shí)加壓。通過(guò)對(duì)發(fā)酵罐通空氣加壓，不僅能使壓力罐保持一定壓力，還可以排出酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的二氧化碳。

19、作為優(yōu)選，所述步驟s3中培養(yǎng)基與微生物發(fā)酵種子液的體積比為100?:?(1~5)。

20、作為優(yōu)選，所述步驟s3中迷迭香均漿濾液的添加總量為發(fā)酵液總體積的20～40%；優(yōu)選地，迷迭香均漿濾液的添加總量為發(fā)酵液總體積的30%。所述的發(fā)酵液總體積是指加完迷迭香均漿濾液后的液體總體積，發(fā)酵過(guò)程中雖然會(huì)有體積變化，但可忽略不計(jì)。

21、作為優(yōu)選，所述步驟s3中不同的微生物菌種采用不同的培養(yǎng)條件：

22、當(dāng)微生物菌種為益生桿菌時(shí)，步驟s3中所用培養(yǎng)基為mrs培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為36～38℃，200～250rpm攪拌發(fā)酵；

23、當(dāng)微生物菌種為酵母菌時(shí)，步驟s3中所用培養(yǎng)基為ypd培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為28～32℃，200～250rpm攪拌發(fā)酵。

24、作為優(yōu)選，所述高壓勻漿的具體條件為30000?psi,100?ml/min最大流量；所述離心條件為0～10℃，8000～10000rpm高速離心20～30min；所述過(guò)濾所用的濾膜為0.22微米；所述步驟s4的處理溫度保持在10℃以下。保持低溫可避免進(jìn)一步酶促發(fā)酵的發(fā)生而影響產(chǎn)品的香味和色澤；通過(guò)過(guò)濾除菌，避免了雜菌對(duì)迷迭香發(fā)酵濾液的分解和破壞，確保迷迭香發(fā)酵濾液不變質(zhì)不分層。

25、本發(fā)明所公開的迷迭香發(fā)酵濾液的制備方法，通過(guò)利用微生物對(duì)迷迭香均漿濾液活性成分充分發(fā)酵，然后依次經(jīng)過(guò)快速冰凍、多次高壓均質(zhì)、高速離心、過(guò)濾等處理步驟，得到迷迭香發(fā)酵濾液，相比于采用傳統(tǒng)的高溫蒸煮水提、有機(jī)溶劑萃取等工藝，本發(fā)明迷迭香發(fā)酵濾液中活性物質(zhì)的產(chǎn)率高，活性強(qiáng)并且生產(chǎn)成本低，無(wú)有機(jī)溶劑殘留。

26、本發(fā)明還提供了一種上述任一所述方法制備的迷迭香發(fā)酵濾液在制備護(hù)膚品、化妝品中的用途。

27、本發(fā)明旨在至少為此，本發(fā)明提出一種迷迭香發(fā)酵濾液的制備方法及其在化妝品中的應(yīng)用實(shí)例，能夠有效利用微生物對(duì)迷迭香原料進(jìn)行生物發(fā)酵和生物活性成分的再加工，反應(yīng)條件溫和，不需要額外添加化學(xué)試劑，迷迭香原料中的多種天然活性成分能得到最大限度的保留，而且微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量的微生物特有的活性多肽、蛋白質(zhì)、β-葡聚糖等活性物質(zhì)，會(huì)顯著增強(qiáng)迷迭香原料的功效性；化妝品中添加適量的迷迭香發(fā)酵濾液可有效修護(hù)皮膚的屏障功能，緩解泛紅、干癢、刺痛、紅腫等敏感性肌膚問題，使皮膚恢復(fù)健康狀態(tài)，在護(hù)膚品以及化妝品行業(yè)具有良好市場(chǎng)前景。

28、本發(fā)明所述迷迭香發(fā)酵濾液的制備方法和應(yīng)用還包括功效檢測(cè)手段選用hacat細(xì)胞增殖、遷移實(shí)驗(yàn)、皮膚屏障相關(guān)蛋白基因表達(dá)檢測(cè)，以及人體刺激性實(shí)驗(yàn)以及人體修護(hù)功效綜合評(píng)估等技術(shù)，保障所得的迷迭香發(fā)酵濾液的質(zhì)量和活性。本發(fā)明制得的迷迭香發(fā)酵液活性物質(zhì)含量高，活性強(qiáng)，無(wú)毒無(wú)刺激性，具有顯著的修護(hù)皮膚屏障效果，且能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖；本發(fā)明還提出了該迷迭香發(fā)酵濾液在化妝品中的應(yīng)用方法，化妝品中添加適量的迷迭香發(fā)酵濾液可修護(hù)皮膚屏障，有效緩解泛紅、干癢、刺痛、紅腫等敏感性肌膚等問題，使皮膚保持年輕健康狀態(tài)。

29、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的創(chuàng)新性：

30、1、該迷迭香發(fā)酵濾液的制備方法工藝簡(jiǎn)單，能夠有效利用益生菌微生物對(duì)迷迭香原料進(jìn)行發(fā)酵和生物活性成分的再加工，反應(yīng)條件溫和，不需要額外添加化學(xué)試劑，迷迭香原料中的多種天然活性成分可以得到最大限度的保留，而且益生菌微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量的益生菌微生物特有的多肽、β-葡聚糖、蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)，會(huì)顯著增強(qiáng)迷迭香原料的功效性，技術(shù)難度小，節(jié)能省工、生產(chǎn)效率高；

31、2、該迷迭香發(fā)酵濾液活性物質(zhì)含量高，活性強(qiáng)，具有顯著的修護(hù)皮膚屏障功效，化妝品中添加該成分可促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖和遷移，修護(hù)皮膚屏障，有效緩解泛紅、干癢、刺痛、紅腫等敏感性肌膚等問題，使皮膚保持年輕健康狀態(tài)；

32、3、該迷迭香發(fā)酵濾液為純天然物質(zhì)發(fā)酵制得，無(wú)添加、安全、無(wú)刺激。