酸棗枝葉提取物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及酸棗枝葉提取物及其制備方法和應(yīng)用，具體 涉及酸棗枝葉提取物及其制備方法和該提取物在制備治療鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁藥物方面的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行病學(xué)調(diào)查表明，西方國(guó)家有不同程度失眠者約為35. 2%。中國(guó)衛(wèi)生部一項(xiàng)統(tǒng)計(jì) 資料也顯示，目前我國(guó)失眠者已達(dá)120萬(wàn)~140萬(wàn)人次，失眠率高達(dá)109Γ20%。據(jù)專(zhuān)家估計(jì)， 到2020年全球失眠者將超過(guò)7億。
[0003] 長(zhǎng)期失眠會(huì)引起人體免疫機(jī)能降低和代謝紊亂，加重原有的心腦血管、消化系統(tǒng) 等疾病，失眠又可以加重抑郁、焦慮障礙，導(dǎo)致嚴(yán)重的心理衛(wèi)生問(wèn)題。抑郁癥是一種常見(jiàn)的 精神障礙，目前其發(fā)病率已躍居世界常見(jiàn)疾病的第四位，專(zhuān)家預(yù)測(cè)今后20年內(nèi)抑郁癥將會(huì) 上升為第二大常見(jiàn)疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，人群中約59Γ6%的人在不同程度上患有抑郁癥。隨著生活 節(jié)奏不斷加快，社會(huì)壓力越來(lái)越大，抑郁癥發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。
[0004] 目前市場(chǎng)上有各種治療失眠、抗抑郁的藥物，雖然能控制疾病，但是仍存在長(zhǎng)期療 效不佳和不良反應(yīng)等方面的缺點(diǎn)，如催眠藥苯二氮類(lèi)(如艾司唑侖、氟西泮、夸西泮和替馬 西泮等）存在明顯副作用，包括精神和行為變化、記憶障礙，長(zhǎng)期用藥時(shí)產(chǎn)生一定耐受性，久 服可能發(fā)生依賴(lài)性和成癮，停藥時(shí)可能出現(xiàn)反跳和戒斷癥狀(失眠、焦慮、激動(dòng)、震顫等)，可 能出現(xiàn)白天殘留作用等。用于抑郁癥治療的藥物如：三環(huán)類(lèi)藥物、單胺氧化酶抑制劑和選擇 性5-HT重吸收抑制劑等，雖有確切的療效，但同時(shí)有多種副作用和禁忌癥，使病人不能耐 受，難以達(dá)到滿意療效，復(fù)發(fā)率高。因此，世界各國(guó)學(xué)者都從植物中尋找強(qiáng)效、無(wú)毒的活性成 分來(lái)開(kāi)發(fā)新藥。傳統(tǒng)中藥有效成分的提取分離工作正受到世界各國(guó)的廣泛專(zhuān)注，從中藥中 提取有效的部位或單體，為新藥的發(fā)現(xiàn)提供了有效手段。
[0005] 酸麥Mill var. (Bunge) Hu ex H. Fu Chow)是鼠 李科棗屬植物，性平，味甘酸，具有很好的開(kāi)胃健脾、生津止渴、消食止滯的療效?！渡褶r(nóng)本草 經(jīng)》中記載，酸棗可以"安五臟，輕身延年"。酸棗仁在臨床上常用于治療神經(jīng)衰弱、心煩失 目民、多夢(mèng)、盜汗、易驚等病。本發(fā)明所述的酸麥枝葉，為鼠李科植物酸麥 Mill var. (Bunge) Hu ex H. Fu Chow)的枝和葉。酸麥枝稱(chēng)"棘刺"，主治消腫， 潰膿，止痛。酸棗葉也稱(chēng)棘葉，主治脛臁瘡，具有麻醉作用，民間多用于泡水代茶飲，治療高 血壓、失眠，經(jīng)臨床驗(yàn)證，酸棗葉對(duì)冠心病也有較好療效。酸棗樹(shù)為野生資源，近年來(lái)，由于 一些地區(qū)野生資源遭到破壞，且一些偏遠(yuǎn)的丘陵地區(qū)的酸棗資源未得到開(kāi)發(fā)，導(dǎo)致酸棗仁 的價(jià)格逐年增長(zhǎng)，其枝葉也只是作為飼料用，造成資源的極大浪費(fèi)。目前對(duì)酸棗仁的化學(xué)成 分和藥理作用研究相對(duì)較多。據(jù)報(bào)道，酸棗仁中含有黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、皂苷類(lèi)、脂肪油、多 糖及有機(jī)酸類(lèi)等多種化合物。而有關(guān)酸棗枝葉的化學(xué)成分研究，有學(xué)者進(jìn)行了酸棗葉總黃 酮的測(cè)定及HPLC-PDA-ESI-MS/MS法鑒定酸棗葉中的三萜類(lèi)、皂苷類(lèi)和黃酮類(lèi)成分。藥理作 用方面，酸棗仁鎮(zhèn)靜催眠抗抑郁作用的研究比較深入，而酸棗枝葉抗失眠和抗抑郁的報(bào)道 較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了有效的利用資源，本發(fā)明提供酸棗枝葉提取物及單體化合物的制備方法，以 及在治療失眠抑郁等中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 1.酸棗枝葉提取物的制備： (1) 將酸棗枝葉粉碎，酸棗枝葉粉末用水或體積濃度為30%_80%醇溶液提取，濃縮成浸 膏； (2) 浸膏加入5~10倍的蒸餾水溶解； (3) 將步驟（2)所得液體通過(guò)大孔樹(shù)脂柱色譜，依次用水、10%-30%乙醇、40%-60%乙醇 和70%-90%乙醇的溶液洗脫； (4) 棄去水、10%-30%乙醇洗脫液，合并40%-60%和70%-90%乙醇洗脫液，減壓濃縮至干， 得到酸棗枝葉提取物。
[0008] 步驟（1)中，藥材粉碎目數(shù)為10-40目，優(yōu)選20目。
[0009] 所述的醇溶液為甲醇、乙醇或正丁醇的含水溶液，優(yōu)選乙醇溶液，濃度優(yōu)選 40%-80%〇
[0010] 所述的水或醇溶液的用量為酸棗枝葉的8-20倍量，優(yōu)選15-20倍。
[0011] 所述的提取所用方法為回流、冷浸或閃式提取，每次I mirTl h，優(yōu)選回流提取。
[0012] 所述的回流提取中，提取時(shí)間為1~3小時(shí)，回流溫度為7(T90°C，優(yōu)選1小時(shí)。
[0013] 冷浸時(shí)間為1~3小時(shí)，優(yōu)選3小時(shí)。
[0014] 閃式提取時(shí)間為20秒~3分鐘，優(yōu)選1分鐘。
[0015] 步驟（2)中，加入蒸餾水的用量為浸膏重量5~10倍，在6(T80°C或超聲的條件下溶 解浸膏； 步驟（3)中，所述的大孔樹(shù)脂為D101、AB-8、HPD-100、HPD-400或HPD-450,優(yōu)選D101、 HPD-100 或 AB-8。
[0016] 步驟（3)包括如下步驟： (a) 用水上柱，沖洗至苯酚-硫酸試液反應(yīng)陰性，水用量為柱體積的1(Γ15倍，流速為 1~2柱體積/小時(shí)； (b) 用體積濃度為10%-30%的乙醇溶液洗脫，沖洗至鹽酸鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性，乙醇用量為柱 體積的ΚΓ20倍，流速為1?2柱體積/小時(shí)；優(yōu)選10%，30%。
[0017] (C)用體積濃度為40%_60%的乙醇溶液上柱，沖洗至鹽酸鎂粉陰性乙醇用量為柱 體積的ΚΓ20倍，流速為1?2柱體積/小時(shí)；優(yōu)選40%，60%。
[0018] (d)用體積濃度為70-90%的乙醇溶液上柱，沖洗至Liebrmann Burchard反應(yīng)陰 性，乙醇用量為柱體積的ΚΓ20倍，流速為廣2柱體積/小時(shí)；優(yōu)選70%，90%。
[0019] 2.酸棗枝葉單體化合物的分離 利用多種分離手段，包括硅膠、聚酰胺、S印hadex LH-20和ODS柱色譜及制備HPLC等， 從酸棗枝葉乙醇提取物中共分離得到16個(gè)化合物，，根據(jù)理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)，確定了化 合物的結(jié)構(gòu)，其中化合物3、4、7、8、15和16為首次從棗屬植物中分離得到。
[0020] 上述16個(gè)化合物是由如下的方法制備： 將40%-60%的乙醇洗脫液濃縮后經(jīng)聚酰胺柱色譜，用乙醇-水系統(tǒng)0:100-90:100梯度 洗脫，其中經(jīng)聚酰胺柱色譜洗脫下的30%乙醇流份再經(jīng)聚酰胺柱色譜，用二氯甲烷-甲醇或 石油醚-丙酮（100:20-100:30)梯度洗脫。得到三個(gè)流份。流份1經(jīng)S印hadex LH-20凝膠 柱色譜，再經(jīng)制備高效液相分離得到化合物1。流份2經(jīng)ODS柱色譜及反復(fù)S印hadex LH-20 凝膠柱色譜，得到化合物2和化合物3。流份3經(jīng)S印hadex LH-20凝膠柱色譜和制備高效 液相得到化合物4、化合物5、化合物6、化合物7和化合物8。
[0021] 將70%_90%的乙醇洗脫液濃縮后經(jīng)硅膠柱色譜，用二氯甲烷-甲醇或石油醚-丙 酮（100:0-100:10)梯度洗脫，得到5個(gè)流份（Fr. 1?Fr. 5)。Fr. 2經(jīng)硅膠柱色譜，S印hadex LH-20凝膠柱色譜及重結(jié)晶等手段得化合物9、化合物10、化合11、化合物12和化合物13。 Fr. 3經(jīng)硅膠柱色譜，用二氯甲烷-甲醇/乙酸乙酯系統(tǒng)梯度（100:1-100:20)洗脫，再用 Sephadex LH-20凝膠柱色譜純化，制備高效液相色譜分離等手段得化合物14。Fr. 5經(jīng) 硅膠柱色譜，用二氯甲烷-甲醇-水（100:10:0-100:20:1)梯度洗脫，再用ODS柱色譜及 Sephadex LH-20凝膠柱色譜等手段得化合物15和化合物16。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包含如上所述的酸棗枝葉提取物。所述的酸棗 枝葉提取物可以和藥學(xué)上可接受的載體混合制備臨床可接受的固體制劑或液體制劑，固體 制劑包括顆粒劑、片劑、膠囊劑等，液體制劑包括，口服液體制劑和注射液體制劑。
[0023] 3.酸棗枝葉提取物抗失眠、抗抑郁作用的研究 (1)酸棗枝葉提取物對(duì)閾上劑量戊巴比妥鈉致小鼠入睡的影響 昆明種小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(生理鹽水)、酸棗仁粗提取物組、陽(yáng)性藥組、酸棗枝葉 40%-60%乙醇洗脫物組、70%-90%乙醇洗脫物組和酸棗枝葉提取物組(實(shí)施例1)，每組8只， 連續(xù)灌胃給藥5 d,于末次給藥60 min后,腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg*kg-l (閾上劑量指 90%的小鼠入睡的劑量)，觀察并記錄小鼠發(fā)生睡眠只數(shù)、睡眠潛伏期及睡眠持續(xù)時(shí)間。以注 射戊巴比妥鈉后15 min內(nèi)翻正反射消失達(dá)I min以上者確定為陽(yáng)性，以注射戊巴比妥鈉后 15 min內(nèi)出現(xiàn)翻正反射消失為睡眠潛伏期；以動(dòng)物翻正反射消失至恢復(fù)為睡眠持續(xù)時(shí)間。 全部數(shù)據(jù)均采用Spss 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。結(jié)果表明各給藥組對(duì)閾上劑量戊巴比妥鈉 致小鼠入睡的睡眠潛伏期均無(wú)顯著性影響，除酸棗枝葉70%-90%洗脫物組外，其他各給藥 組均能顯著增加小鼠睡眠時(shí)間（P〈0.01)。
[0024] (2)酸棗枝葉提取物對(duì)對(duì)氯苯丙胺酸（PCPA)致失眠大鼠血清細(xì)胞因子的影響 研究表明，中樞的細(xì)胞因子參與睡眠的調(diào)節(jié)，其中白細(xì)胞介素 -I (IL-I)和腫瘤壞死因 子-α (TNF-α)在睡眠調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。IL-I是一種具有致睡作用的細(xì)胞因子， 當(dāng)睡眠剝奪時(shí)IL-I以及其他促睡眠物質(zhì)在體內(nèi)的蓄積標(biāo)志著睡眠的積累，這些物質(zhì)給機(jī) 體以睡眠壓力，從而形成睡眠剝奪后的睡眠"反跳"現(xiàn)象，以補(bǔ)償所失去的睡眠。IL-I包括 IL-I a、IL-I β和IL-lRa(IL-l受體拮抗劑)。IL-I β是血液循環(huán)中的主要形式，生理功能 較強(qiáng)，所以目前大多以IL-I β研究為主。TNF-α與IL-I具有類(lèi)似的睡眠調(diào)節(jié)作用。TNF-α 在免疫系統(tǒng)影響睡眠過(guò)程中起到中介的作用，可通過(guò)提高腦內(nèi)5-羥色胺（5-ΗΤ)的更新率， 增強(qiáng)5-ΗΤ能神經(jīng)元的功能，延長(zhǎng)慢波睡眠時(shí)間。本研究觀察酸棗枝葉提取物對(duì)對(duì)氯苯丙胺 酸（PCPA)致失眠大鼠血清細(xì)胞因子的影響。
[0025] 選用SD大鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、酸棗枝葉粗提物組、酸棗仁粗提取物組、 陽(yáng)性藥組、酸棗枝葉40%-60%乙醇洗脫物組、70%-90%乙醇洗脫物組和酸棗枝葉提取物組 (實(shí)施例1)，每組8只，除空白組外，其他各組均于每天上午