一種穩(wěn)定的復(fù)合輔酶制劑、其制備方法及應(yīng)用
【專利說明】
[0001] 本申請是2013年7月17日提交的申請?zhí)枮?01310298764. 9、發(fā)明名稱為"一種 穩(wěn)定的復(fù)合輔酶制劑、其制備方法及應(yīng)用"申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，發(fā)明的核心在于提供了一種穩(wěn)定的復(fù)合輔酶藥物制 劑、其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 輔酶是人體物質(zhì)代謝中重要而不可缺少的輔助因子。輔酶復(fù)合物因富含多種活性 成分（輔酶A、輔酶I、GSH、ATP等）及其相互間的協(xié)同增效功能，而對機(jī)體的新陳代謝、蛋 白質(zhì)合成、組織及生理功能的動態(tài)平衡等具有重要的促進(jìn)作用，是臨床上治療急慢性肝炎、 原發(fā)性血小板減少性紫癜、冠狀動脈硬化、腎功能不全等疾病的重要輔助藥物（秦榜勇余 志豪等，2009 ;沈忠明朱俊毅等，200710037422. 6;RebeccaA.Faulkner，AndrewD.Nguyen etc.，2013)。
[0004] 酵母是單細(xì)胞真核生物，其細(xì)胞中含有糖、脂肪、蛋白質(zhì)、核酸等生物物質(zhì)代謝 必需的各種酶（PaulN.Black，NilsJ.Faergeman，etc.，2000;JasminaMarjanovic， DominikaChalupska，etc.，2010 ;任雷，任喬，200810063121. 5)，國外 70 年代研制出的注 射用復(fù)合輔酶針劑就是以酵母為基礎(chǔ)（QinLiu，RodrigoM.P.Siloto，etc.，2011 ;鄭學(xué)昌， 200410058086.X)。
[0005]目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)中未見關(guān)于穩(wěn)定的復(fù)合輔酶藥物制劑組合物的相關(guān)專利報道。 中國專利檢索到兩篇相關(guān)專利文獻(xiàn)。其中"一種復(fù)合輔酶的制備方法及其復(fù)合輔酶藥和臨 床的用途"，【申請?zhí)枴?004158086.X，描述了一種制造復(fù)合輔酶的方法，并對該方法及制造出 來的產(chǎn)物進(jìn)行了保護(hù)（鄭學(xué)昌，200410058086.X)。其獨立權(quán)利要求是"一種制造方法"，其 它權(quán)利要求均為從屬權(quán)利要求。"一種復(fù)合輔酶藥的制備方法"，【申請?zhí)枴?01010503237. 3， 描述了復(fù)合輔酶的另一種制造方法，并對該方法作為獨立權(quán)項進(jìn)行了保護(hù)（廖元秋， 201010503237. 3)。該兩項專利均未提及制造產(chǎn)物作為藥品所要求的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，無從考察 其穩(wěn)定性能；同時，上述文獻(xiàn)未涉及制劑學(xué)數(shù)據(jù)，未從制劑研宄角度考慮處方組成。
[0006] 然而，目前小分子多肽類及酶類藥物的穩(wěn)定性是現(xiàn)今制藥業(yè)制劑科學(xué)家的主要挑 戰(zhàn)。環(huán)境中存在多種引起酶類及小分子多肽類可逆和不可逆變化的應(yīng)力。這些困難提出了 對穩(wěn)定這些靈敏小分子多肽及酶類的實際的要求。在復(fù)合輔酶組成成分中，C〇A、SAM、ADP、 AMP、ATP、GSH等多種物質(zhì)均存在結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定性，在不同的溫度、酸堿度、氧化還原因素 或組合因素下具有不同的穩(wěn)定性能。制劑開發(fā)的關(guān)鍵步驟，需要選擇并加入一定的穩(wěn)定劑、 賦形劑等，并對這些組分及配比進(jìn)行研宄摸索，獲得穩(wěn)定的臨床藥用制劑（王崧，2010 ;威 廉?埃爾德奇，尼爾?庫利等，200680012072. 1)。所以，制劑組成是制劑的關(guān)鍵，而制劑的穩(wěn) 定性是一個不可或缺的檢測指標(biāo)，是臨床用藥質(zhì)量的根本保證。與此同時，凍干工藝也是不 容忽視的一項關(guān)鍵技術(shù)，目前尚未見到關(guān)于復(fù)合輔酶制備中凍干工藝條件的相關(guān)報道。然 而，針對復(fù)合輔酶這種對熱比較敏感、又具有一定表面活性的小分子多肽類藥物而言，找到 凍干過程中合適的溫度和時間并不是一件容易的事，凍干條件掌控不好，不但會導(dǎo)致藥品 外觀不好，更重要的是會導(dǎo)致凍干后產(chǎn)品萎縮，即導(dǎo)致商業(yè)化生產(chǎn)中廢品率很高，且批件質(zhì) 量不穩(wěn)定，難以制備及長期保存。
[0007] 除此之外，就上述已獲授權(quán)的兩項專利本身涉及的方法而言，在生產(chǎn)應(yīng)用過程中 存在一定弊端：首先，兩種方法中使用高速離心（20000-35000CPM和10000-15000G)，離心 時間較長（30-60分鐘），這樣的條件對儀器設(shè)備質(zhì)量要求非常高，且耗能極大，在生產(chǎn)中很 難實現(xiàn)，對環(huán)境造成嚴(yán)重污染；其次，"一種復(fù)合輔酶藥的制備方法"專利中直接對離心液進(jìn) 行超濾，在實際生產(chǎn)過程中易造成超濾柱的堵塞，大大降低過濾速度，甚至使過濾停止，對 填料造成極大浪費；再次，按此方法小規(guī)模生產(chǎn)出的復(fù)合輔酶原料，其穩(wěn)定性也較難控制， 批間重現(xiàn)性差；最后，兩個專利中凍干工藝條件不明確，按照常規(guī)方法又很難重復(fù)得到穩(wěn)定 的凍干產(chǎn)品。
[0008] 由此可知，發(fā)明一種簡便易行的方法替代復(fù)雜步驟具有重要的創(chuàng)新價值及現(xiàn)實應(yīng) 用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 我公司在復(fù)合輔酶研制方面進(jìn)行了大量的文獻(xiàn)檢索分析及實驗工作，首次提供了 一種穩(wěn)定的復(fù)合輔酶制劑及其制備方法，該方法有別于現(xiàn)有的制備方法，更簡單易行，可重 復(fù)性強(qiáng)。同時對該制劑中的所有成分的配比及優(yōu)選的含量范圍進(jìn)行了研宄，提供了一種優(yōu) 化的配比方案。特別地，在研宄中驚喜地發(fā)現(xiàn)在原料藥中按一定比例加入一定比例的葡萄 糖酸鈣、鹽酸半胱氨酸及甘露醇三種成分可起到極好的穩(wěn)定效果。
[0010] 在整個研制過程中，我們對比了不同的緩沖體系，如弱酸及其鹽緩沖體系 (HAc-NaAc)、弱堿及其鹽緩沖體系（NH3 ?H2O-NH4Cl)、多元弱酸的酸式鹽及其對應(yīng)的次級鹽 緩沖體系（NaH2PO4-Na2HPO4)。其中醋酸作為緩沖劑，易使原液pH不穩(wěn)定，凍干前后差異較 大；NH3.H2O--NH4Cl緩沖劑，有一定刺激性；磷酸鹽緩沖劑在溶液中含有磷，且調(diào)節(jié)范圍廣， 不易控制。我們也對比了不同的抗氧化劑在制劑中的應(yīng)用效果，如谷胱甘肽及維生素C等， 結(jié)果表明用谷胱甘肽及維生素C效果不理想；我們還對比了常用的賦形劑，如蔗糖、磷酸鈣 二水化合物等，用蔗糖充當(dāng)賦形劑，在注射時會引起血糖一過性升高，我們認(rèn)為這對糖尿病 人非常不利；而用磷酸鈣作為賦形劑，在檢測過程中發(fā)現(xiàn)溶液中磷酸根離子有少量增加，PH 值有波動。最后，我們驚喜地發(fā)現(xiàn)，在復(fù)合輔酶制劑中加入葡萄糖酸鈣、鹽酸半胱氨酸及甘 露醇三種成分，這三種成分按一定比例混合可起到極好的穩(wěn)定效果，此效果通過大量實驗 已得到證實。以葡萄糖酸鈣作為藥學(xué)緩沖劑作用顯著，溶液pH穩(wěn)定，無有害離子加入，更意 想不到的是，加入葡萄糖酸鈣后，起到了一種營養(yǎng)增補(bǔ)的作用，動物實驗表明，注射加入葡 萄糖酸鈣的復(fù)合輔酶溶液后，小鼠的毛細(xì)管通透性降低，心肌收縮加強(qiáng)，血液離子平衡得到 一定程度的調(diào)節(jié)；我們以鹽酸半胱氨酸作為抗氧化劑，發(fā)現(xiàn)其抗氧化作用極強(qiáng)，且易被快速 吸收，同時也可以起到一定的營養(yǎng)補(bǔ)充劑的作用；我們選擇甘露醇作為賦形劑，之前對比過 它與其他賦形劑的理化特性，發(fā)現(xiàn)甘露醇突出表現(xiàn)為無吸濕性，干燥快，化學(xué)穩(wěn)定性好，所 以，我們賦形后得出的產(chǎn)品外觀特性良好，三種成分按一定比例混合，大大增強(qiáng)了復(fù)合輔酶 的穩(wěn)定性，延長保質(zhì)期，臨床效果突出。
[0011] 在生產(chǎn)過程中本發(fā)明首次采用低轉(zhuǎn)速離心（4390G，遠(yuǎn)低于現(xiàn)有專利中介紹的 20000-35000CPM和10000-15000G)，效果明顯，節(jié)約能源；同時本發(fā)明首次公布了復(fù)合輔 酶凍干粉針的凍干工藝，該工藝通過長期、多次摸索，反復(fù)實驗得出，凍干效果良好，可控性 強(qiáng)，參考價值大，大大減少了在產(chǎn)品凍干過程中存在的賦形不好，水分超標(biāo)，穩(wěn)定性差等問 題。1.本發(fā)明中提供的制劑通過以下方案實現(xiàn)：
[0012] 1)將冰凍新鮮酵母菌取出，加入純水?dāng)嚢杌靹颍粚乙杭訜嶂?0~97°C，立即冷 卻至20°C使菌體破壁。充分破壁后2810G-5120G，4~KTC，離心20分鐘收取粗提上清液。 本步驟中采用溫差破壁，低轉(zhuǎn)速離心，克服了當(dāng)前已有方法中采用高轉(zhuǎn)速（20000-35000CPM 和10000-15000G)離心的不足之處，降低了對機(jī)器的要求，從而節(jié)約了成本，更適合大規(guī)模 生產(chǎn)，增加了批間重現(xiàn)性。
[0013] 2)取對應(yīng)粗提液上清體積的活性炭裝柱，用純水沖洗平衡柱體。粗提液上清液調(diào) pH值至5~5. 5上柱，用氨乙醇洗脫液洗脫，收集洗脫液；
[0014] 3)將洗脫液蒸發(fā)濃縮，將濃縮液調(diào)至pH值7. 0,用2~5倍純水稀釋后上陰離子交 換柱，用20mMpH8.0磷酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫液樣品。本步驟克服了現(xiàn)有方法中直接 超濾的缺點，由于上一步中獲得的洗脫液分子量為5000-8000道爾頓，所以在實際操作中， 易造成超濾住的堵塞，大大降低過濾速度，甚至使過濾停止；
[0015] 4)將洗脫樣品用截留分子量為5000道爾頓的超濾器超濾，以潔凈容器接取濾過 液；
[0016] 5)在步驟4)所的濾過液中，加水稀釋，稀釋后每毫升含有輔酶A(C〇A)90_120U、 輔酶I(NAD) 0? 1-0. 3mg/ml、谷胱甘肽（GSH)l-5mg/ml、三磷酸腺苷（ATP) 1-2. 5mg/ml、黃 素單核苷酸（FMN)1.8-12yg/ml、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD)3-13yg/ml、二磷酸腺苷 (ADP)O. 1-0. 4mg/ml、一磷酸腺苷（AMP)O. 2-0. 4mg/ml、腺苷蛋氨酸（SAM)L2-15yg/ml;
[0017] 6)在步驟5)的稀釋液中加入下列物質(zhì)，并使其終濃度為：葡萄糖酸鈣1.5-4mg/ ml、鹽酸半胱氨酸0. 8-1. 2mg/ml、甘露醇0. 6-5mg/ml配制成中間品；中間品用分子量5000 道爾頓的超濾器超濾，收集濾出液；
[0018] 7)將步驟6)收集的濾出液經(jīng)除菌、灌裝；
[0019] 8)灌裝結(jié)束后，對產(chǎn)品進(jìn)行常規(guī)預(yù)凍，達(dá)到要求后進(jìn)行一次干燥、二次干燥，壓塞。