hsa-miR-487a在制備治療或術(shù)后預(yù)防肝癌的藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種內(nèi)源性的非編碼小miRNAs、包含其的藥物組合物，以及其用于治 療或術(shù)后預(yù)防肝癌的新用途，特別地，涉及一種hsa-miR-487a用于治療或術(shù)后預(yù)防肝癌藥 物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 眾所周知，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌）是全球男性第 五大常見腫瘤，具有預(yù)后惡劣、死亡率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅我國人民的生命與健康。如2008 年世界新增肝癌病例為7483萬人，而同年肝癌死亡病例高達(dá)到6959萬人，其發(fā)病率與死 亡率幾近1:1。盡管近年來隨著影像診斷與手術(shù)技術(shù)的不斷進(jìn)步以及以索拉非尼為代表的 肝癌靶向治療藥物的面世，為肝癌的早期診斷與治療提供了可能與更多且更有效的治療選 擇，使肝癌的治療水平得到了一定的提高。
[0003] 然而，綜觀目前肝癌臨床治療現(xiàn)狀，肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍高居不下，術(shù)后5年生 存率仍徘徊在30%上下，嚴(yán)重的制約了肝癌總體治療水平的提高，無法使之得到根本性的 改善。宄其原因就是尚未完全弄清楚肝癌發(fā)生、發(fā)展與侵襲轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制。這嚴(yán)重制約 了對(duì)肝癌進(jìn)展過程的理解和對(duì)新的治療肝癌藥物的研發(fā)。因此，如何深入研宄探討HCC發(fā) 生、發(fā)展與侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制已成為現(xiàn)今HCC研宄領(lǐng)域中的一個(gè)十分重要科學(xué)問題。
[0004] 微小RNA (microRNAs，簡稱miRNAs)是一類長度約為20~24nt，有顯著生物學(xué)意 義的內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的單鏈小RNA分子。miRNA于基因轉(zhuǎn)錄后階段發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)控作 用。據(jù)已有文獻(xiàn)估計(jì)，miRNA能夠?qū)w內(nèi)約1/3的蛋白合成起到調(diào)控作用，miRNAs可廣泛參 與不同生理及病理過程的調(diào)節(jié)，如發(fā)育、凋亡、分化、增殖、代謝、應(yīng)激等。
[0005] 鑒于miRNA常常定位于染色體易于丟失、重排、擴(kuò)增的脆點(diǎn)，致使miRNA定位的染 色體脆點(diǎn)部分易于出現(xiàn)缺失、重排、擴(kuò)增，進(jìn)而導(dǎo)致miRNA表達(dá)出現(xiàn)異常，并直接導(dǎo)致細(xì)胞 增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡等功能也隨之發(fā)生異常改變，誘使腫瘤細(xì)胞的出現(xiàn)。miRNA強(qiáng)大的功 能及特殊的生成、調(diào)控方式已經(jīng)吸引了眾多學(xué)者的關(guān)注，目前大量研宄已證明miRNA在腫 瘤的發(fā)生、增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡方面均發(fā)揮重要的作用，在腫瘤的診斷、預(yù)后評(píng)估、 治療等領(lǐng)域開始嶄露頭角。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明人通過研宄發(fā)現(xiàn)了與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移和 肝癌增殖過程密切相關(guān)的分子機(jī)制，并利用在該分子機(jī)制中起關(guān)鍵作用的小分子RNA-- hsa-miR-487a的表達(dá)量的變化和作用通路，提供了用于治療肝癌的藥物組合物。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種藥物組合物，其包含小分子核酸 hsa_miR-487a〇
[0008] 進(jìn)一步地，小分子核酸hsa-miR-487a與遞送載體相連接后用于藥物組合物中D
[0009] 進(jìn)步一地，遞送載體為嗎啉代核酸。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了一種小分子核酸hsa-miR-487a在制備治療或 術(shù)后預(yù)防肝癌的藥物中的應(yīng)用。
[0011] 進(jìn)步一地，應(yīng)用包括將小分子核酸hsa-miR_487a與遞送載體連接后用于藥物中。
[0012] 進(jìn)步一地，遞送載體為嗎啉代核酸。
[0013] 進(jìn)步一地，藥物為用于肝癌的生長期或肝癌轉(zhuǎn)移期的藥物。
[0014] 進(jìn)步一地，含有小分子核酸hsa-miR_487a的肝癌診斷試劑盒。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用于檢測(cè)肝癌的試劑盒，試劑盒包括小分 子核酸 hsa_miR-487a。
[0016] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0017] 1.本發(fā)明通過研宄首次證實(shí)hsa-miR-487a的作用通路，及其具有可促進(jìn)肝癌細(xì) 胞的侵襲轉(zhuǎn)移與增殖的作用的特性。利用該特性，將具有該結(jié)構(gòu)的miRNA與現(xiàn)有的藥物載 體相結(jié)合，給藥后，該藥物能有效抑制動(dòng)物體內(nèi)該基因的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖和 轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到提高肝癌患者預(yù)后的目的。
[0018] 2.本發(fā)明提供的hsa-miR_487a的應(yīng)用包括了對(duì)于肝癌的治療或術(shù)后預(yù)防。
[0019] 3.本發(fā)明通過研宄首次證實(shí)名為hsa-miR-487a的miRNA在肝癌中存在高表達(dá)，利 用該RNA的這一特性，可以用于制備檢測(cè)潛在肝癌患者的試劑盒。
[0020] 除了上面所描述的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)之外，本發(fā)明還有其它的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。 下面將參照?qǐng)D，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
【附圖說明】
[0021] 構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí) 施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0022] 圖1示出肝細(xì)胞癌芯片結(jié)果示意圖；
[0023] 圖2示入選550例患者的納入排除及分組過程的流程示意圖；
[0024] 圖3示hsa-miR-487a在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平，其中圖A與圖B分別示訓(xùn)練隊(duì)列 和驗(yàn)證隊(duì)列中肝癌hsa-miR_487a的表達(dá)水平，紅線示癌組織中hsa-miR_487a高于癌旁組 織2倍水平，在兩個(gè)隊(duì)列中分別有85/132與43/66例樣本中癌組織hsa-miR-487a表達(dá)水 平高于癌旁組織兩倍以上；圖C示在兩個(gè)隊(duì)列中，統(tǒng)計(jì)顯示癌組織中hsa-miR-487a表達(dá)水 平均顯著高于癌旁組織；圖D示在兩個(gè)隊(duì)列肝細(xì)胞癌的三種亞型中，hsa-miR-487a在高轉(zhuǎn) 移潛能的亞型NHCC中表達(dá)顯著高于低轉(zhuǎn)移潛能的SHCC與SLHCC組；
[0025] 圖4示肝癌組織與癌旁組織中hsa-miR-487a表達(dá)水平。采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)肝 癌組織石賭固定切片中hsa-miR-487a表達(dá)水平。圖A示陰性對(duì)照原位雜交探針Scramble 結(jié)果圖，圖B示作為內(nèi)參及陽性對(duì)照的原位雜交探針U6結(jié)果圖，圖C示采用hsa-miR-487a 探針檢測(cè)檢測(cè)樣本中hsa-miR-487a表達(dá)水平。圖片中藍(lán)色為原位雜交探針陽性顆粒，紅色 為核固紅非特異性核染料。圖中可見hsa-miR-487a在肝癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織， 兩者之間可看到顯著的分界線；
[0026] 圖5示正常肝細(xì)胞系與肝癌細(xì)胞系中hsa-miR_487a表達(dá)水平。采用realtime-PCR 檢測(cè)原代肝細(xì)胞系（PHH)，正常肝細(xì)胞系（L02)與肝癌細(xì)胞系〇fepG2, PLC，Bel7402， 皿!1〇：97-1^，5麗07721，!111117，!1印38，]\^〇：97-!1，!^〇1〇)細(xì)胞系中11831^1?-4873的表達(dá)水平。 hsa-miR-487a在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)均高于正常肝細(xì)胞系；
[0027] 圖6示肝癌組織中高表達(dá)hsa-miR_487a的患者往往具有相對(duì)差的總體生存率與 無病生存率。圖A與圖B分別示意訓(xùn)練隊(duì)列與驗(yàn)證隊(duì)列中hsa-miR-487a高低表達(dá)組中總 體生存率和無病生存率。hsa-miR-487a低表達(dá)組中患者具有較好的術(shù)后總體生存率與無病 生存率；
[0028] 圖7示采用慢病毒感染肝癌細(xì)胞系感染效率。亮視野（Brightfield)示光鏡下所 見，綠色熒光（GFP)示同視野下成功被感染慢病毒的細(xì)胞。疊加圖（Merge)則是將亮視野與 綠色熒光圖疊加后所獲得的圖片，可清晰看出鏡下已成功感染病毒與未感染病毒的細(xì)胞；
[0029] 圖8示采用慢病毒感染肝癌細(xì)胞系后其中hsa-miR-487a的表達(dá)水平。圖A 示空白的HCCLM3細(xì)胞系（untreated)和HCCLM3細(xì)胞系感染hsa-miR-487a干預(yù)病毒 (Anti-hsa_miR-487a)或陰性對(duì)照病毒（Negative control，NC)后其中 hsa_miR-487a 表 達(dá)水平。圖B示空白的HepG2細(xì)胞系（untreated)和HepG2細(xì)胞系感染hsa-miR_487a過 表達(dá)病毒（hsa_miR-487a)或陰性對(duì)照病毒（Negative control，NC)后其中 hsa_miR-487a 表達(dá)水平；
[0030] 圖9示hsa-miR-487a具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖的作用。圖A示7天細(xì)胞增殖曲 線，可見干預(yù)hsa-miR_487a表達(dá)后（Anti-hsa_miR-487a)可抑制肝癌細(xì)胞系HCCLM3的增 殖能力，而過表達(dá)hsa-miR-487a后可促進(jìn)肝癌細(xì)胞系H印G2的增殖能力。圖B左圖示克隆 形成試驗(yàn)結(jié)果，右圖示克隆數(shù)目統(tǒng)計(jì)，干預(yù)hsa-miR-487a表達(dá)后細(xì)胞克隆形成能力下降， 過表達(dá)hsa-miR-487a表達(dá)后細(xì)胞克隆形成能力增強(qiáng)。圖C左圖示細(xì)胞周期結(jié)果圖，右圖示 結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，統(tǒng)計(jì)結(jié)果示hsa-miR-487a能夠促進(jìn)細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入G2/M期；
[0031] 圖10示采用Edu染料標(biāo)記增殖細(xì)胞證實(shí)hsa-miR-487a促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。圖 AH〇echeSt33342為細(xì)胞核染料，標(biāo)記所有細(xì)胞細(xì)胞核為藍(lán)色。Edu為胸腺嘧啶類似物，標(biāo)記 處于增殖周期的細(xì)胞系為紅色。Overlay示將Hoechest33342與Edu圖疊加，紅色細(xì)胞為處 于增殖期細(xì)胞，藍(lán)色為處于靜息期的細(xì)胞。圖B為圖A中各組中處于增殖期的細(xì)胞占細(xì)胞 總數(shù)的比例；
[0032] 圖11示hsa-miR-487a具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與迀移能力的作用。圖A示 hsa-miR-487a促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。左圖示Transwe