針對海產(chǎn)魚的類結(jié)節(jié)病的dna疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于誘導針對魚類感染類結(jié)節(jié)病的病原菌美人魚發(fā)光桿菌殺魚 亞種t/affise/ae 5^5/7. piscicit/a)的保護性免疫的 DNA 疫苗。
[0002] 本說明書中的"類結(jié)節(jié)?。╬seudotuberculosis，假結(jié)核?。?是指由A t/affise/ae 5^5/7. Ms1CiciiZa的感染引起的類結(jié)節(jié)病，因此，不僅包含在青甘魚（Seriola quinqueradiata，螄魚）類中發(fā)病的類結(jié)節(jié)病，還包含在青甘魚類以外的魚類[例如屬于魚盧 形目（Perciformes)的魚類（黑鯛、真鯛、赤點石斑魚等）、屬于胡瓜魚目（Osmeriformes) 的魚類（香魚等）、屬于飩形目（Tetraodontiformes)的魚種（綠鰭馬面飩等）等]中因相 同病原菌而發(fā)病的巴氏桿菌病（Pasteurellosis)。
【背景技術(shù)】
[0003] 在以海鮮類為代表的眾多水生生物的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中，作為封閉系統(tǒng)的養(yǎng)殖領(lǐng)域中的 病毒性疾病和細菌性疾病，由于個體高密度地存在，因此這些感染的影響巨大，成為養(yǎng)殖產(chǎn) 業(yè)中的嚴重問題。
[0004] 類結(jié)節(jié)?。ɑ虬褪蠗U菌?。┳鳛?963年在美國切薩皮克（Chesapeake)灣中白魚盧 魚（Roccus americanus，美洲白辦）大量死亡的病原疾病而首次被報道（非專利文獻1)。 在日本，1968年在四國南西的養(yǎng)殖青甘魚0歲魚中觀察到該病的發(fā)生，第二年1969年在西 日本一帶的養(yǎng)殖青甘魚中流行。另外，并非只有青甘魚類，在黑鯛、真鯛、赤點石斑魚、香魚、 綠鰭馬面飩等魚種中也有發(fā)生，由于該病具有極強的傳染性，因此成為威脅海產(chǎn)養(yǎng)殖的問 題（非專利文獻1)。
[0005] /I 屬于發(fā)光桿菌屬，是呈現(xiàn)革蘭氏陰性兼性厭氧 性的非運動性短桿菌（0. 6~1. 2X0. 8~2. 6 #m)的一科。該細菌的增殖適溫為25~ 30°C，最佳pH為7. 5~8. 0,最佳食鹽濃度為2~3%，對氨節(jié)西林（Ampicillin)、奧索利酸 (Oxolinic acid)、氟苯尼考（Florfenicol)等顯示出敏感性。該病的癥狀以在脾臟和腎臟 中形成Imm左右的小白點為特征。小白點是細菌集落配置點，多數(shù)被纖維組織包圍形成結(jié) 節(jié)。這些菌集落的形成是基于：可耐受吞噬細胞的細胞內(nèi)消化，并在吞噬細胞內(nèi)發(fā)生增殖， 從而在毛細血管或間質(zhì)組織內(nèi)形成菌球（非專利文獻2)。
[0006] 在日本，雖然針對該病已經(jīng)批準了滅活疫苗，但滅活疫苗難以誘導細胞免疫。然 而，細胞免疫的誘導能力高的疫苗還幾乎沒有開發(fā)（專利文獻1和專利文獻2)。
[0007] 在細菌感染癥的預防或治療中通常使用疫苗。疫苗有滅活疫苗（日本腦炎、外氏 病等）、類毒素（破傷風、白喉等）、減毒疫苗（卡介苗（BCG)、脊髓灰質(zhì)炎等）、基因重組疫 苗（乙型肝炎病毒等）等。滅活疫苗和使外毒素無毒化而獲得的類毒素是誘導對抗這些疾 病的抗體的比較安全的疫苗。與滅活疫苗相比，基因重組疫苗不含雜質(zhì)，因此被認為是更安 全的疫苗。
[0008] 但是，雖然這些疫苗可以誘導抗體的產(chǎn)生，但難以誘導細胞免疫，這是其缺點。另 外，滅活疫苗和減毒疫苗需要在產(chǎn)業(yè)上大量獲得作為抗原的蛋白，必須適當?shù)卦鲋巢≡?而且，通過減毒疫苗獲得的免疫效果雖然大多能夠長期維持，但另一方面被指出具有副作 用、危險性。認為滅活疫苗和基因重組疫苗在宿主內(nèi)的抗原持續(xù)性短，需要佐劑等。現(xiàn)有的 這些疫苗從制備到接種到被檢體內(nèi)這段期間需要冷藏保存，因此存在著成本增加和效力降 低的問題。
[0009] 最近，疫苗的研宄開發(fā)正在推進，通過給予編碼免疫原性蛋白的質(zhì)粒DNA，開發(fā)了 帶來免疫誘發(fā)的新疫苗種類（DNA疫苗），如下所述改善了現(xiàn)有疫苗的不利。即，由于DNA疫 苗不僅可以誘導體液免疫應答，還可以強效誘導細胞免疫，因此具有以下優(yōu)點：可以賦予對 感染癥的保護能力；可以高度純化；在室溫或高溫下也穩(wěn)定，無需冷藏保存即可長期貯藏； 通過基因工程學方法容易迅速地改良DNA疫苗；以及縮短疫苗開發(fā)所花費的時間等。
[0010] 已知通過向肌肉內(nèi)注射編碼桿狀病毒UfeMorirw1S)的結(jié)構(gòu)蛋白的糖蛋白的基 因，會刺激虹鱒和比目魚的免疫應答（非專利文獻3)。另外，關(guān)于虹鱒和比目魚有DNA疫苗 的報道（非專利文獻4)。但在其他魚種中沒有DNA疫苗的報道。
[0011] 現(xiàn)有技術(shù)文獻 專利文獻 專利文獻1 :日本特開平9-176043號公報； 專利文獻2 :日本特開2002-003400號公報； 非專利文獻 非專利文獻 1:S. F. Snieszko 等人，"Bacteriology"，（美國），1964 年，88 卷， 第 1814-1814 頁； 非專利文獻2:若林久嗣、室賀清邦編集，"魚介類ω感染癥·寄生蟲癥"，（恒星社厚 生閣），2004年，第206-211頁； 非專利文獻3 :P. Boudinot等人，"Virology"，（美國），1998年，249卷，第 297-306 頁； 非專利文獻 4 :McLauchlan 等人，"Fish and shellfish Immunology"，（英國）， 2003 年，15 卷，第 39-50 頁。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 發(fā)明所要解決的課題 本發(fā)明的課題在于提供：用于誘導針對類結(jié)節(jié)病的保護性免疫的魚類用DNA疫苗。
[0013] 用于解決課題的手段 本發(fā)明人深入研宄了對海產(chǎn)魚的類結(jié)節(jié)病有效的疫苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：將攜帶編碼A damselae 5?辦577· 的月旨蛋白(Lipoprotein: ppal: SEQ ID NO: I)、DegQ 絲 氨酸蛋白酶（DegQ serine protease: ppa2: SEQ ID NO: 3)和外膜蛋白 A 前體（Outer membrane protein A precursor: pparsl: SEQ ID NO: 5)的基因的質(zhì)粒 DNA 混合或分別 接種給比目魚和紅甘鰺（紅甘）時，具有對抗海產(chǎn)魚的類結(jié)節(jié)病的免疫效果、以及增加免疫 相關(guān)基因的表達量。而且，將這些序列按照比目魚的密碼子使用頻率進行序列變換形成人 工基因 （SEQ ID NO: 7、9、11)，將攜帶該基因的質(zhì)粒DNA也同樣進行接種時，發(fā)現(xiàn)各自具有 高的免疫防除效果，完成了本發(fā)明。
[0014] BP，本發(fā)明涉及下述的[1]~[9]。
[0015] [1] [1]的魚類用DNA疫苗，其特征在于，包含下述物質(zhì)作為有效成分：包含編碼 針對美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種的免疫原性多肽的核苷酸序列或?qū)⒃撔蛄懈鶕?jù)比目魚的密 碼子使用頻率進行修飾而獲得的核苷酸序列的DNA、或包含上述DNA的表達載體；
[2] [1]的魚類用DNA疫苗，其中，上述免疫原性多肽是由選自美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞 種的ppal、ppa2和pparsl的基因編碼的多肽或其部分片段；
[3] [2]的魚類用DNA疫苗，其中，上述免疫原性多肽是由SEQ IDNO: 2、4或6所表示 的氨基酸序列構(gòu)成的多肽或其部分片段；
[4] [1]的魚類用DNA疫苗，其中，上述免疫原性多肽是：⑴包含SEQ ID NO: 2、4或 6所表示的氨基酸序列的多肽；（2)包含SEQ ID NO: 2、4或6所表示的氨基酸序列中有1 個或多個氨基酸被缺失、取代或添加而獲得的氨基酸序列、且具有針對美人魚發(fā)光桿菌殺 魚亞種的免疫原性的修飾多肽；或（3)與SEQ ID NO: 2、4或6所表示的氨基酸序列的同源 性為80%以上、且具有針對美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種的免疫原性的同源多肽；或者它們的 部分片段；
[5] [1]的魚類用DNA疫苗，其中，上述核苷酸序列是：（1) SEQIDN0: 1、3、5、7、9或 11所表示的核苷酸序列；或（2)與SEQ IDN0: 1、3、5、7、9或11所表示的核苷酸序列的同 源性為80%以上、且編碼具有針對美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種的免疫原性的多肽的核苷酸序 列；或者它們的部分序列；
[6] [1]的魚類用DNA疫苗，其中，上述表達載體為包含天然型基因的質(zhì)粒wild-ppal、 wild_ppa2 或 wild-pparsl、或者包含修飾基因的質(zhì)粒 opt-ppal、opt_ppa2 或 opt-pparsl ;
[7] 類結(jié)節(jié)病的預防或治療方法，其特征在于：對魚給予[1]~[6]中任一項的魚類用 DNA疫苗；
[8] [7]的方法，其中，上述魚為屬于鱸形目、飩形目或胡瓜魚目的魚；
[9] [1]~[6]中任一項的魚類用DNA疫苗在誘發(fā)針對海產(chǎn)魚的類結(jié)節(jié)病的免疫應答 中的應用。
[0016] 另外，本發(fā)明還涉及： 魚類用DNA疫苗用的或類結(jié)節(jié)病的預防或治療用的DNA、或包含上述DNA的表達載體， 所述DNA包含編碼針對美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種的免疫原性多肽的核苷酸序列；以及 DNA或包含上述DNA的表達載體在制備魚類用DNA疫苗中的應用，所述DNA包含編碼針 對美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種的免疫原性多肽的