及其混合物。如果需要，還可以加入膳食纖維。膳食纖維通過小腸， 不被酶消化，并且作為天然膨脹劑（bulkingagent)和輕瀉藥起作用。膳食纖維可以是可溶 性的或不溶性的，一般優(yōu)選兩種類型的摻合物。膳食纖維的適合來源包括、但不限于大豆、 豌豆、燕麥、果膠、瓜爾膠、阿拉伯膠、低聚果糖和低聚半乳糖。
[0047] 含有微粒組合物的營養(yǎng)組合物可以進(jìn)一步包含礦物質(zhì)和微量營養(yǎng)素，例如痕量元 素和維生素。營養(yǎng)組合物中任選存在的礦物質(zhì)、維生素和其它微量營養(yǎng)素的實(shí)例包括維生 素A、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、維生素E、維生素K、維生素C、維生素D、葉 酸、肌醇、煙酸、生物素、泛酸、膽堿、鈣、磷、碘、鐵、鎂、銅、鋅、錳、氯化物、鉀、鈉、硒、鉻、鉬、 ?；撬岷蚅-肉堿。礦物質(zhì)通常以鹽形式添加。
[0048] 含有所述微粒組合物的營養(yǎng)組合物可以包含一種或多種食品級乳化劑，例如 單-和二-甘油酯的二乙?；剖狨?、卵磷脂以及單-和二-甘油酯。類似地，可以包含 適合的鹽和穩(wěn)定劑。
[0049] 在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了治療接受對象的免疫相關(guān)疾患的方 法。該疾患可以與任意情況有關(guān)，在所述情況中用包含益生菌的微粒配制物遞送增強(qiáng)的免 疫益處作用可降低發(fā)生疾病的風(fēng)險(xiǎn)或緩解疾患的癥狀。這類免疫相關(guān)病癥可以從（但不限 于）變應(yīng)性障礙（例如特應(yīng)性皮炎、食物變態(tài)反應(yīng)癥狀、嗜酸性食管炎、變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性 哮喘）到炎性障礙（例如潰瘍性結(jié)腸炎、局限性回腸炎、多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎、免疫缺陷綜合 征）。所述方法包括給需要其的接受對象施用由脫乙酰殼多糖制成的并且包含益生菌或非 復(fù)制性益生菌的并且具有約1微米一約20微米的尺寸的微粒組合物。所述微粒組合物可 以進(jìn)一步包含益生元。所述微粒組合物可以被加入到適合的營養(yǎng)組合物中并且以任意適合 的方式施用給接受對象。
[0050] 在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了在免疫抑制的個(gè)體、中老年個(gè)體、危 重個(gè)體、住院的接受對象或手術(shù)患者中遞送提高的免疫加強(qiáng)作用的方法。
[0051] 在本文所公開的任意實(shí)施方案中，在基于脫乙酰殼多糖的微粒和益生菌和/或非 復(fù)制性益生菌的每種營養(yǎng)組合物中可以存在濃度范圍為IO5-IO12的微粒?；蛘?，該濃度可 以為IO7-IOici的微粒。
[0052] 在本文所公開的任意實(shí)施方案中，在基于脫乙酰殼多糖的微粒和益生菌和/或非 復(fù)制性益生菌的每種營養(yǎng)組合物中可以存在終濃度為營養(yǎng)組合物重量的0. 05% -5%。
[0053] 在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了給健康的接受對象遞送提高的免疫 加強(qiáng)的方法，從而導(dǎo)致預(yù)防任何不希望的急性或慢性免疫相關(guān)障礙。
[0054] 所述微粒組合物可以用文獻(xiàn)中所述的適合的技術(shù)制備，這取決于所生成的顆粒的 類型和尺寸范圍。膠囊形成過程的流程實(shí)例如圖2中所示，其包括（a)具有脫乙?；潭菵A 的脫乙酰殼多糖的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)；(b)油包水液滴界面上第一層脫乙酰殼多糖/PfacidYN復(fù)合的略圖；和（c)磷脂脂肪酸（phosphatidicfattyacid)分子的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0055] 對于基于脫乙酰殼多糖的微粒，舉例性的形成方法描述在本文件的實(shí)施例1 中，并且包括乳化步驟。對于基于殼多糖或葡聚糖的顆粒，可以使用研磨或微研磨 (micro-milling)方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括提供具有大于20微米的尺寸且 包含益生菌的顆粒的混懸液，隨后的步驟允許將尺寸分布減小至1-20微米的范圍。減小尺 寸分布的步驟可以通過用適宜孔徑的過濾器過濾（例如用20微米孔徑的過濾器以除去較 大的顆粒；用1微米孔徑的過濾器過濾以便僅保留大于1微米的顆粒）和/或通過使用離 心-再分散步驟進(jìn)行。當(dāng)進(jìn)行離心步驟時(shí)，顆粒按照它們的尺寸和平均密度在離心管中沉 降。在基于脫乙酰殼多糖的微粒的情況下，離心使得大于1微米的顆粒能集中在管底部，從 而允許容易地除去較小的顆粒。然后可以將所述微粒組合物以任意適合的量加入到任意適 合的營養(yǎng)組合物中。
[0056] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了制備微粒組合物的方法。所述方法包括 提供具有大于20微米的尺寸并且包含益生菌和益生元的顆粒的混懸液，和使用與上面的 段落中所述的將顆粒尺寸分布減小至1-20微米范圍的步驟相同的步驟。然后可以將本公 開內(nèi)容的微粒組合物以任意適合的量加入到任意適合的營養(yǎng)組合物中。例如，所述微粒組 合物可以用在藥物應(yīng)用、醫(yī)用食品、食品補(bǔ)充劑、全營養(yǎng)配方等中。
[0057] 用于生產(chǎn)微粒組合物的具體方法的詳細(xì)描述公開在WO2011/101415和"Gunes等 人SoftMatter, 7, 9206(2011) "中，通過引用將這兩篇文獻(xiàn)合并入本文。 實(shí)施例
[0058] 實(shí)施例1 _制備微粒的方法
[0059] 脫乙酰殼多糖是通過堿處理由殼多糖（聚-b-1，4-D-N-乙?；咸前罚┑拿撘阴?化獲得的碳水化合物聚合物，其一般結(jié)構(gòu)可以在文獻(xiàn)中找到。例如，參見Gunes等人，Soft Matter, 7, 9206(2011)。其結(jié)構(gòu)取決于其脫乙?；潭?，一般為60 % - 99% (例如100 %脫 乙?；梢缘玫骄跠-葡糖胺，其設(shè)定了靜電電荷密度）?；诿撘阴ざ嗵堑慕M合物中所 用的磷脂脂肪酸銨是稱作卵磷脂YN的卵磷脂，其購自Palsgaard(例如PalgaarC^ 4448， 食品級E442,通常用作巧克力配制物中的粘度調(diào)節(jié)劑）。卵磷脂YN在任意溫度下都不溶于 水。它可溶于常用的食用油和熔化的脂肪，至多溶解每升幾克。磷脂酸分子在卵磷脂YN中 的主要PKa值為3. 0和8. 0,因此，當(dāng)吸附在具有約3或更高的pH的油/水界面上時(shí)，分子 攜帶大量的負(fù)電荷；所述量是在pH3下0.25。在低于脫乙酰殼多糖鏈的pKa的pH下，脫 乙酰殼多糖的酸-堿（acido-basic)基團(tuán)的主要部分是帶電荷的。
[0060]膠囊形成
[0061] 1.濃度在0. 1 _I. 0%w/w范圍內(nèi)的脫乙酰殼多糖溶液是通過將脫乙酰殼多糖粉 末分散在水中制備的（平均分子量MW典型地在1〇〇, 〇〇〇 - 500, 000g/mol，但可以更低或更 高；此處為300, 000g/mol)，脫乙?；潭葹?0%。使用氯化物酸（chlorideacid)實(shí)現(xiàn)適 當(dāng)?shù)娜芙?，以便將pH設(shè)定在3。在本實(shí)施例中，脫乙酰殼多糖在水中的濃度為0. 24%w/w。 對于膠囊制造，pH為3。
[0062] 2.將卵磷脂YN溶于中鏈甘油三酯油，濃度為0.1 -0.5 %w/w。卵磷脂YN在油中 的濃度為0. 5%w/w。
[0063] 3.通過使用機(jī)械分散方法、典型地是高速轉(zhuǎn)子-定子將步驟2中形成的卵磷脂YN 油溶液在pH3下分散在水中形成了乳劑，油與水的體積比典型地為1. 0% -40%。在本實(shí) 施例中，所用的方法是上面剛剛描述的這種方法。
[0064] 4.將步驟3中形成的乳劑與步驟1中制備的脫乙酰殼多糖溶液以1:1的重量比通 過柔和的機(jī)械混合來混合。
[0065] 5.將步驟4中形成的分散物保持在靜態(tài)或保持在溫和機(jī)械攪拌下，其使界面的殼 的厚度增加、在本實(shí)施例中增加4天。
[0066] 6.使用幾個(gè)尺寸精制步驟：
[0067] 6. 1通過20ym孔徑的過濾器進(jìn)行過濾。保留滲透物并且將其進(jìn)一步加工。
[0068] 6. 2.以2000m. ^T2g進(jìn)行兩次離心-再稀釋步驟。在每次離心步驟后，除去膠囊中 稀少的上清液。使用Millipore水進(jìn)行再稀釋步驟。用氫氧化鈉（0.01mol/L)將最終pH值 調(diào)整至7。最終顆粒濃度和膠囊尺寸在1-20ym范圍內(nèi)，最大概率（maximumprobability) 在IOym。所獲得的顆粒分散物可以被進(jìn)一步噴霧干燥。
[0069] 實(shí)施例2&3
[0070] 申請人已經(jīng)令人驚訝地1且出乎預(yù)料地發(fā)現(xiàn)，脫乙酰殼多糖微粒和益生菌菌株 的組合具有協(xié)同作用并且增加IFN-Y從外周血單核細(xì)胞（"PBMC"）中產(chǎn)生（實(shí)施例 2)。用從當(dāng)?shù)剌斞荆╰ransfusionfacility)獲得的血液過濾器獲得了來自4位不同的 健康志愿者的PBMC。將血液用HBSS( "Hank平衡鹽溶液"）稀釋。然后將稀釋的血液在 Histopaque-1077梯度上分層并且于室溫以500g離心20min。從界面層收集PBMC，用HBSS 洗滌2次，然后計(jì)數(shù)。將PBMC濃度調(diào)整至1.5XIO6活細(xì)胞/ml。通過在37°C與5.0%CO2 在48-孔板中處理培養(yǎng)500微升IxlO6細(xì)胞混懸液。所有處理均一式四份地進(jìn)行。孵育36 小時(shí)后，收集上清液部分用于ELISA分析。用多路徑試劑盒測定細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的細(xì) 胞因子。如圖3中所示，與單獨(dú)的微粒（"MP"）或益生菌刺激相比，脫乙酰殼多糖微粒配 制物和益生菌菌株的組合誘導(dǎo)了高2-倍的免疫響應(yīng)（IFN-Y產(chǎn)生增加）。與單獨(dú)的MP或 益生菌刺激相比，使用脫乙酰殼多糖微粒和益生菌的組合所得到的免疫特性還是理想的免 疫加強(qiáng)特性（實(shí)施例3)，因?yàn)樗档兔庖咭种菩约?xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生，同時(shí)導(dǎo)致增加的 IFN-Y產(chǎn)生。在圖4中清楚地顯示了這種作用。這類特性在免疫受損的接受對象（例如免 疫缺陷綜合征、癌癥）中可以是有益的。
[0071] 實(shí)施例4
[0072] 含有基于脫乙酰殼多糖的微粒膠囊分散物以及益生菌（或者作為替代選擇，益生 元、非復(fù)制性益生菌）的組合物可以口服施用給接受對象，以遞送免疫加強(qiáng)作用。這類組 合物使得益生菌和微粒在腸粘膜免疫系統(tǒng)的界面上被專門的細(xì)胞例如M-細(xì)胞和樹突細(xì)胞 ("DC"）有效地?cái)z取，其最終活化這些細(xì)胞上的模式識別受體（"PRR"）并且引發(fā)比單獨(dú) 施用的益生菌或微粒更穩(wěn)健的協(xié)同免疫響應(yīng)。如圖5中所示，可以以3種不同的方式遞送 得到的含有基于脫乙酰殼多糖的微粒膠囊分散物和益生菌（或者作為替代選擇，益生元和 /或非復(fù)制性益生菌）的組合物，從而產(chǎn)生協(xié)