抗整聯(lián)蛋白β1抗體組合物及其使用方法
【專利說明】抗整聯(lián)蛋白β1抗體組合物及其使用方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請根據(jù)35USC§ 119(e)要求2012年12月26日提交的美國申請序列號 61/746,023的權益。先前申請的公開內(nèi)容被視為本申請的公開內(nèi)容的一部分，并且以引用 的方式整體并入本申請的公開內(nèi)容。
[0003] 序列表的并入
[0004] 隨附序列表中的材料據(jù)此以引用的方式并入本申請。名為0NC01100_1W0_ Sequence_Listing的隨附序列表文本文件于2013年12月23日創(chuàng)建，并且是81KB。所述 文件可在使用Windows OS的計算機上利用Microsoft Word進行評估。
[0005] 發(fā)明背景 發(fā)明領域
[0006] 本發(fā)明大體上涉及免疫學領域，并且更具體來說涉及抗整聯(lián)蛋白抗體及其使用方 法。
[0007] 背景信息
[0008] 在發(fā)達世界，癌癥是死亡的主要病因之一，僅在美國導致每年超過500, 000例死 亡。在美國，每年有超過100萬人被診斷有癌癥，并且總之據(jù)估計超過三分之一人在他們的 壽命期間將顯現(xiàn)某種形式的癌癥。盡管存在超過200種不同類型的癌癥，但它們之中包括 乳癌、肺癌、結腸直腸癌和前列腺癌的四種占所有新病例的超過一半。
[0009] 乳癌是女性中最常見的癌癥，其中估計12%的女性在她們的壽命期間處于顯現(xiàn)所 述疾病的風險下。盡管死亡率已由于較早檢測和改進的治療而降低，但乳癌仍然是中年女 性的主要死亡病因。此外，轉移性乳癌仍然是一種不可治愈疾病。在呈現(xiàn)時，大多數(shù)患有轉 移性乳癌的患者僅有一個或兩個器官系統(tǒng)受影響，但隨著疾病進展，多個部位通常變得受 牽連。轉移性牽連的最常見部位是胸壁的皮膚和軟組織中以及腋窩和鎖骨上區(qū)域中的局部 區(qū)域性復發(fā)。遠端轉移的最常見部位是骨（30-40%的遠端轉移），繼之以肺和肝。盡管僅 約1-5%的患有新診斷乳癌的女性在診斷時具有遠端轉移，但約50%的患有局部疾病的患 者最終在5年內(nèi)伴有轉移而復發(fā)。目前，自顯現(xiàn)遠端轉移開始的中值存活期是約3年。 [0010] 當前診斷和分期乳癌的方法包括腫瘤-結節(jié)-轉移（TNM)系統(tǒng)，其依賴于腫 瘤尺寸、腫瘤在淋巴結中的存在以及遠端轉移的存在，如American Joint Committee on Cancer :AJCC Cancer Staging Manual. Philadelphia,Pa. :Lippincott-Rav en Publishers，第 5 版，1997，第 171-180 頁以及 Harris，J R: "Staging of breast carcinoma"，Harris，J. R.，Heilman，S.，Henderson，I. C，Kinne D. W.(編）：Breast Diseases. Philadelphia，Lippincott，1991中所述^這些參數(shù)用于提供預后，并且選擇適當 療法。也可評估腫瘤的形態(tài)學外觀，但因為具有類似組織病理學外觀的腫瘤可展現(xiàn)顯著臨 床可變性，所以這個方法具有嚴重局限性。最后，針對細胞表面標記的測定可用于將某些腫 瘤類型分成子類。舉例來說，在乳癌的預后和治療中考慮的一個因素是雌激素受體（ER)的 存在，因為ER陽性乳癌通常比ER陰性腫瘤更易于對如他莫昔芬（tamoxifen)或芳香酶抑 制劑的激素療法應答。盡管適用，但這些分析僅部分預測乳房腫瘤的臨床特性，并且在乳癌 中存在當前診斷工具未能檢測，并且當前療法未能治療的許多表型多樣性。
[0011] 在發(fā)達世界，前列腺癌是男性中最常見的癌癥，在美國占所有新癌癥病例的估計 33%，并且是第二最常見的死亡病因。自從引入前列腺特異性抗原（PSA)血液測試，早期檢 測前列腺癌已顯著改進存活率，并且在診斷時患有局部和區(qū)域性時期前列腺癌的患者的5 年存活率接近100%。但超過50%的患者將最終顯現(xiàn)局部晚期或轉移性疾病。
[0012] 當前根治性前列腺切除術和放射療法提供對大多數(shù)局部化前列腺腫瘤的治愈性 治療。然而，針對晚期病例的治療選項極其有限。對于轉移性疾病，用單獨或與抗雄激素劑 組合的黃體生成激素釋放激素（LHRH)激動劑進行雄激素剝奪（androgen ablation)是標 準治療。然而，盡管最大阻斷雄激素，但所述疾病幾乎始終進展，其中大多數(shù)顯現(xiàn)雄激素非 依賴性疾病。目前，不存在一致接受的針對激素難治性前列腺癌的治療，并且通常使用化學 治療方案。
[0013] 肺癌是全世界最常見的癌癥，在美國是第三最通常診斷的癌癥，并且到目前為止 是最常見的癌癥死亡病因。抽煙據(jù)信導致所有肺癌的估計87%，從而使得它成為最致命的 可預防疾病。肺癌被分成占所有肺癌的超過90%的兩種主要類型：小細胞肺癌（SCLC)和 非小細胞肺癌（NSCLC)。SCLC占病例的15-20%，并且特征在于它來源于大中心氣道中，并 且組織學組成是具有少許細胞質的小細胞的薄片。SCLC比NSCLC更具侵襲性，快速生長，并 且在早期且常常轉移。NSCLC占所有病例的80-85%，并且基于組織學被進一步分成三種主 要亞型：腺癌、鱗狀細胞癌（表皮樣癌）和大細胞未分化癌。
[0014] 肺癌通常在它的病程中的晚期呈現(xiàn)，并且因此在診斷之后具有僅6-12個月的中 值存活期以及僅5-10 %的總體5年存活率。盡管手術提供最佳治愈機會，但僅小部分肺癌 患者符合條件，其中大多數(shù)依賴于化學療法和放射療法。盡管試圖操縱這些療法的時間選 擇和劑量強度，但存活率歷經(jīng)過去15年已少許增加。
[0015] 結腸直腸癌是全世界第二最常見的癌癥和第四最常見的癌癥死亡病因。所有結腸 直腸癌的約5-10%是遺傳性的，其中一種主要形式是家族性腺瘤多發(fā)性息肉（FAP)，這是 一種常染色體顯性疾病，其中約80%的受影響個體在腺瘤結腸多發(fā)性息肉（APC)基因中含 有生殖系突變。結腸直腸癌具有通過圓周性生長以及在其它地方通過淋巴性、血原性、經(jīng)腹 膜性和神經(jīng)周性散布進行局部侵襲的傾向。淋巴外牽連的最常見部位是肝，其中肺是最常 受影響的腹部外器官。血原性散布的其它部位包括骨、腎、腎上腺和腦。
[0016] 當前對結腸直腸癌的分期系統(tǒng)是基于腫瘤通過腸壁的滲透程度以及存在或不存 在結節(jié)牽連。這個分期系統(tǒng)由三種主要杜克氏分類法（Duke'S classification)來規(guī)定： 杜克氏A疾病限于結腸或直腸的粘膜下層；杜克氏B疾病具有通過固有肌層進行侵襲，并 且可滲透結腸壁或直腸壁的腫瘤；并且杜克氏C疾病包括任何程度的腸壁侵襲，伴有區(qū)域 性淋巴結轉移。盡管手術切除高度有效針對早期結腸直腸癌，提供杜克氏A患者的治愈率 95 %，但在杜克氏B患者中，治愈率降低至75 %，并且在杜克氏C疾病中存在陽性淋巴結預 測在5年內(nèi)有60%的復發(fā)可能性。用手術后化學療法過程治療杜克氏C患者使復發(fā)率降低 至40% -50%，并且現(xiàn)在是針對這些患者的護理標準。
[0017] 頭頸部的上皮癌產(chǎn)生于頭頸部區(qū)域中的粘膜表面，并且在來源方面通常是鱗狀細 胞。這個種類包括鼻旁竇、口腔以及鼻咽、口咽、下咽和喉的腫瘤。
[0018] 在美國，頭頸部癌的年度新病例數(shù)是每年約40, 000,占成人惡性腫瘤的約5%。在 一些其它國家，頭頸部癌更常見，并且全世界發(fā)病可能超過每年50萬例。在北美和歐洲，月中 瘤通常產(chǎn)生于口腔、口咽或喉，而在地中海國家和遠東，鼻咽癌更常見。
[0019] 盡管適用，但傳統(tǒng)療法（放射療法、化學療法和激素療法）模式已因出現(xiàn)治療抗性 癌細胞而受限制。明確的是，需要用以鑒定用于治療頭頸部癌以及一般來說癌癥的靶標的 新方法。
[0020] 胰腺癌是一種源于產(chǎn)生在形成胰腺的組織中的轉化細胞的惡性贅瘤。占這些腫瘤 的95 %的最常見類型的胰腺癌是產(chǎn)生在胰腺的外分泌組成部分內(nèi)的腺癌（根據(jù)光顯微術 展現(xiàn)腺性構造的腫瘤）。少數(shù)產(chǎn)生于胰島細胞，并且被分類為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。胰腺癌在美 國是第四并且在全世界是第八最常見的癌癥相關死亡病因。
[0021] 多形性成膠質細胞瘤（GBM)是成人中最常見的惡性腦腫瘤，其中在最大限度治療 下的中值存活期小于1年。迄今為止，僅三種藥物已由FDA核準用于GBM治療，并且總體存 活率在超過25年中尚未得以改進。
[0022] 整聯(lián)蛋白是負責在正常狀態(tài)與病理狀態(tài)（如炎癥和癌癥）兩者下機械感測微環(huán) 境，并且引發(fā)細胞外-基質（ECM)誘導的信號傳導的細胞粘著分子。重要的是，整聯(lián)蛋白位 于細胞和微環(huán)境的界面處，從而在腫瘤進展以及調(diào)控生長和存活路徑方面起關鍵作用。許 多類型的整聯(lián)蛋白的上調(diào)已與上皮惡性腫瘤相關聯(lián)，特別是在侵襲、轉移和血管生成的過 程期間。重要的是，協(xié)調(diào)廣泛得多的功能性活性（如炎癥、增殖、粘著和侵襲）的β?整聯(lián) 蛋白新近已牽涉于多種實體癌癥模型和造血性惡性腫瘤中的治療抗性中。重要的是，這個 β1整聯(lián)蛋白介導的抗性被認為發(fā)生在腫瘤細胞自身的水平上。除以上所述之外，β 1整聯(lián) 蛋白通過促進血管內(nèi)皮細胞的迀移而在腫瘤血管化（如VEGF依賴性和VEGF非依賴性血管 生成）期間具有重要功能。抑制β?整聯(lián)蛋白會通過多種潛在機理來克服對抗血管生成療 法的抗性：（1)防止在任何經(jīng)典ECM基底上的血管共選擇和/或生長/侵襲；（2)在如電離 輻射的傷害之后降低腫瘤細胞的活力；（3)直接抑制腫瘤細胞增殖；(4)直接抑制血管化過 程；以及（5)抑制通常在產(chǎn)生療法抗性之后所見的侵襲性間質表型，包括球狀生長。
[0023] 鑒于整聯(lián)蛋白β 1在如上討論的較廣泛功能性活性方面的作用，如整聯(lián)蛋白β 1 靶向抗體的抗整聯(lián)蛋白β 1組合物也可在免疫性/炎性疾病中是重要的。此外，可通過整聯(lián) 蛋白M路徑加以靶向的疾病和病癥包括多發(fā)性硬化癥、克羅恩氏?。–rohn's disease)、 類風濕性關節(jié)炎、炎性腸病等。類似地，將預期可靶向某些眼相關疾病，包括濕性年齡相關 的黃斑部變性（AMD)。
[0024] 發(fā)明概述
[0025] 本發(fā)明是基于產(chǎn)生特異性結合整聯(lián)蛋白β 1的具有人框架序列的人源化抗體。已 知整聯(lián)蛋白β 1是一種在實體腫瘤中過表達的蛋白質，并且因此作為適用于表征、研宄、診 斷和治療癌癥的癌細胞標記。此外，已證明整聯(lián)蛋白β?會通過精密協(xié)調(diào)生長和來自腫瘤 微環(huán)境的存活信號來驅動對常規(guī)（例如化學療法和電離輻射）和靶向（例如曲妥珠單抗 (trastuzumab)、貝伐單抗（bevicizumab)、拉帕替尼（Iapatinib))療法的癌抗性。在過去， 人源化嘗試已受可用人框架的數(shù)目限制。本發(fā)明滿足對用于特異性結合整聯(lián)蛋白β1的抗 體的其它人框架序列的需要。
[0026] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種特異性結合整聯(lián)蛋白β 1的人源化抗體。所 述抗體包括重鏈可變（VH)區(qū)和輕鏈可變（VL)區(qū)，其中所述VH區(qū)與具有如SEQ ID NO: 2所 示氨基酸序列的VH區(qū)具有小于約97%、96%或95%同一性，并且其中所述VL區(qū)與具有如 SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的VL區(qū)具有小于約97%、96%或95%同一性。
[0027] 在另一實施方案中，VH 區(qū)與具有如 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10、 SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:29-43 和 SEQ ID N0:91-100 所示氨基酸序列的 VH區(qū)具有超過75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。在實施方案中，￥1^區(qū)與具有如 SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:44-57 和 SEQ ID 勵：107-116所示氨基酸序列的￥1^區(qū)具有超過75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性。
[0028] 在另一實施方案中，抗體具有來自如0S2966的供體抗體的VH和VL區(qū)的⑶R。在 實施方案中，VH區(qū)的CDR具有如SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 25所示氨基 酸序列，并且VL區(qū)的CDR具有如SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 28所示氨基 酸序列。
[0029] 在一個方面，本發(fā)明提供一種包括本發(fā)明的VH和VL區(qū)的抗體。
[0030] 在另一方面，本發(fā)明提供一種編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子。
[0031] 在另一方面，本發(fā)明提供一種包括本發(fā)明的核酸分子的載體。
[0032] 在另一方面，本發(fā)明提供一種包括本發(fā)明的載體的分離的宿主細胞。
[0033] 在另一方面，本發(fā)明提供藥物組合物。在一個實施方案中，藥物組合物包括本發(fā)明 的抗體和藥學上可接受的載體。在一個實施方案中，藥物組合物包括本發(fā)明的核酸分子和 藥學上可接受的載體。
[0034] 在另一方面，本發(fā)明提供一種包括連接于檢測或治療部分的本發(fā)明的抗體的免疫 綴合物。
[0035] 在另一方面，本發(fā)明提供一種包括可操作地連接于如細胞因子的單獨肽的本發(fā)明 的抗體的嵌合蛋白。
[0036] 在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種治療受試者的疾病的方法。在實施方案中，所 述方法包括向受試者施用本發(fā)明的抗體、本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的藥物組合物、本發(fā)明 的免疫綴合物或本發(fā)明的嵌合蛋白，由此治療疾病。在一個實施方案中，疾病是細胞增生性 病癥，如癌癥。
[0037] 在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種檢測受試者的疾病的方法。所述方法包括使 本發(fā)明的抗體或免疫綴合物與來自受試者的樣品接觸；通過與整聯(lián)蛋白β 1特異性結合來 檢測整聯(lián)蛋白β 1的水平；以及比較整聯(lián)蛋白β 1的檢測水平與正常樣品中的整聯(lián)蛋白 β 1的水平，其中相較于正常樣品，來自受試者的樣品中的整聯(lián)蛋白β 1的水平增加指示疾 病。
[0038] 在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種與具有如SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO:29-43 和 SEQ ID NO:91-100 所示氨基酸 序列的VH區(qū)具有超過75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的VH區(qū)。
[0039] 在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種與具有如SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ IDN0:20、SEQIDN0:22、SEQIDN0:44-57 和SEQIDN0:107-116所示氨基酸序列的VL 區(qū)具有超過75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的￥1^區(qū)。
[0040] 附圖簡述
[0041] 圖1是描繪由雜交瘤0S2966產(chǎn)生的抗體0S2966的VH區(qū)的核酸和氨基酸序列的 圖示表示。
[0042] 圖2是描繪由雜交瘤0S2966產(chǎn)生的抗體0S2966的VL區(qū)的核酸和氨基酸序列的 圖示表示。
[0043] 圖3是描繪對由雜交瘤0S2966產(chǎn)生的抗體0S2966的⑶R的分析的圖示表示，所 述CDR用于本發(fā)明的抗體的VH和VL區(qū)中。
[0044] 圖4是描繪由雜交瘤產(chǎn)生的抗體0S2966的⑶R的氨基酸序列的圖示表示，所述 CDR用于本發(fā)明的抗體的VH和VL區(qū)中。
[0045] 圖5是描繪一個實施方案中的本發(fā)明的抗體的VH區(qū)的核酸和氨基酸序列的圖示 表示。對保守⑶R加下劃線。
[0046] 圖6是描繪一個實施方案中的本發(fā)明的抗體的VH區(qū)的核酸和氨基酸序列的圖示 表示。對保守⑶R加下劃線。
[0047] 圖7是描繪一個實施方案中的本發(fā)明的抗體的VH區(qū)的核酸和氨基酸序列的圖示 表示。對保守⑶R加下劃線。
[0048] 圖8是描繪一個實施方案中的本發(fā)明的抗體的VH區(qū)的核酸和氨基酸序列的圖示 表示。對保守⑶R加下劃線。
[0049] 圖9是描繪一個實施方案中的本發(fā)明的抗體的VH區(qū)的核酸和氨基酸序列的圖示 表示。對保守⑶R加下劃線。
[0050] 圖10是描繪一個實施方案中的本發(fā)明的抗體的VL區(qū)的核酸和氨基酸序列的圖示 表示。對保守⑶R加下劃線。
[0051] 圖11是描繪一個實施方案中的本發(fā)明的抗體的VL區(qū)的核酸和氨基酸序列的圖示 表示。對保守⑶R加下劃線。
[0052] 圖12是描繪一個實施方案中的本發(fā)明的抗體的VL區(qū)的核酸和氨基酸序列的圖示 表示。對保守⑶R加下劃線。
[0053] 圖13是描繪一個實施方案中的本發(fā)明的抗體的VL區(qū)的核酸和氨基酸序列的圖示 表示。對保守⑶R加下劃線。
[0054] 圖14是載體的示意圖。
[0055] 圖15是描繪本發(fā)明的人源化VH鏈相較于抗體0S2966的VH(SEQ ID NO: 2)的序 列分析和比對的圖示表示。圖15的序列如下：0S2966是SEQ ID N0:2;變體1是SEQ ID NO:6 ;變體 2 是 SEQ ID NO: 8 ;變體 3 是 SEQ ID NO: 10 ;變體 4 是 SEQ ID NO: 12 ;變體 5 是 SEQ ID NO: 14 ;變體 6 是 SEQ ID NO: 29 ;變體 7 是 SEQ ID NO: 30 ;變體 8 是 SEQ ID NO: 31 ; 變體9是 SEQ ID N0:32;變體 10 是 SEQ ID N0:33;變體 11 是 SEQ ID N0:34;變體 12是 SEQ ID NO:35 ;變體 13 是 SEQ ID NO:36 ;變體 14 是 SEQ ID NO:37 ;變體 15 是 SEQ ID NO:38 ; VH2 是 SEQ ID NO:91 ;變體 16 是 SEQ ID NO:92 ;VH4 是 SEQ ID NO:93 ;變體 17 是 SEQ ID N0:94;VH5 是 SEQ ID N0:95;變體 18 是 SEQ ID N0:96;VH6 是 SEQ ID N0:97;變體 19 是 SEQ ID N0:98;VH7 是 SEQ ID N0:99;并且變體 20 是 SEQ ID N0:100。
[0056] 圖16是描繪對應于圖15中所示的比對的本發(fā)明的人源化J區(qū)（VH)的序列分析 和比對的圖示表示。序列如下：Jl是SEQ ID NO: 101 J2是SEQ ID NO: 102 J3是SEQ ID NO: 103 J4 是 SEQ ID NO: 104 J5 是 SEQ ID NO: 105 ;并且 J6 是 SEQ ID NO: 106。
[0057] 圖17是描繪本發(fā)明的人源化VL鏈相較于抗體0S2966的VL(SEQ ID NO:4)的序 列分析和比對的圖示表示。序列如下：0S2966是SEQ ID N0:4;變體1是SEQ ID NO: 16;變 體 2 是 SEQ ID NO: 18 ;變體 3 是 SEQ ID NO: 20 ;變體 4 是 SEQ ID NO: 22 ;變體 5 是 SEQ ID NO:44;變體 6 是 SEQ ID NO:45;變體 7 是 SEQ ID NO:46;變體 8 是 SEQ ID NO:47;變體 9 是 SEQ ID N0:48;變體 10 是 SEQ ID N0:49;變體 11 是 SEQ ID N0:50;變體 12 是 SEQ ID NO:51;變體 13 是 SEQ ID NO:52 ;VkI 是 SEQ ID NO: 107;變體 14 是 SEQ ID NO: 108 ;VkII 是 SEQ ID NO: 109 ;變體 15 是 SEQ ID NO: 110 ;VkIII 是 SEQ ID NO: 111 ;變體 16 是 SEQ ID NO: 112 ;VkIV 是 SEQ ID NO: 113 ;變體 17 是 SEQ ID NO: 114 ;VkVI 是 SEQ ID NO: 115 ;并且 變體 18 是 SEQ ID NO: 116。
[0058] 圖18是描繪對應于圖17中所示的比對的本發(fā)明的人源化J區(qū)（κ輕鏈）的序列 分析和比對的圖示表示。序列如下：Jl是SEQ ID NO: 117 J2是SEQ ID NO: 118 J3是SEQ ID NO: 119 J4 是 SEQ ID NO: 120 ;并且 J5 是 SEQ ID NO: 121。
[0059] 圖19是描繪本發(fā)明的VH和VL鏈的密碼子使用的圖示表示。
[0060] 圖20是描繪本發(fā)明的復合人抗體變體（表2中所示的那些）的相對親和力的圖 解表示。
[0061] 圖21是描繪本發(fā)明的復合人抗體變體（表2中所示的那些）的相對親和力的圖 解表示。
[0062] 圖22是描繪本發(fā)明的復合人抗體變體（表2中所示的那些）的相對親和力的圖 解表示。
[0063] 圖23是描繪本發(fā)明的復合人抗體變體（表2中所示的那些）的相對親和力的圖 解表示。
[0064] 圖24是描繪本發(fā)明的復合人抗體變體（表2中所示的那些）的相對親和力的圖 解表示。
[0065] 圖25A-D是說明本發(fā)明的復合人抗體變體在細胞外基質（ECM)粘著測定中的功能 性驗證的一系列圖解表示。在粘著微板測定中評估在多種ECM上以及在多種癌細胞系中， 本發(fā)明的復合人抗體變體（來自表2)對整聯(lián)蛋白β 1亞單位的功能性抑制。圖25A利用 PANC-I人胰腺癌。圖25Β利用PANC-I人胰腺癌。圖25Β利用PANC-I人胰腺癌。圖25C利 用MDA-MB-231人三陰性乳癌。圖2?利用AsPC-I人胰腺癌。
[0066] 圖26Α-Β是說明本發(fā)明的復合人抗體變體在細胞外基質（ECM)迀移測定中的功能 性驗證的一系列圖示和圖解表示。在微板"刮擦創(chuàng)傷"迀移測定中評估在ECM組分纖維結 合蛋白上，使用人三陰性乳癌細胞（MDA-MB-231)，本發(fā)明的復合人抗體變體（來自表2)對 整聯(lián)蛋白β?亞單位的功能性抑制。圖26Α是各板在10Χ放大倍數(shù)下的一系列圖像，其顯 示在0S2966和復合人變體（Η1、Η2、Η3)處理的孔中，向創(chuàng)傷中的迀移得以減弱。圖26Β是 在各條件下對無細胞區(qū)域的定量（一式三份并且重復進行）的圖。
[0067] 圖27Α-Β是說明本發(fā)明的復合人抗體變體在用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC)進行的 血管形成血管生成測定中的功能性驗證的一系列圖示和圖解表示。在血管生成的體外模型 (即用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC)進行的血管形成測定）中評估本發(fā)明的復合人抗體變體 (來自表2)對整聯(lián)蛋白β 1亞單位的功能性抑制。圖27Α是各板在10Χ放大倍數(shù)下的一 系列圖像，其顯示在0S2966和復合人變體（Η1、Η2、Η3)處理的孔中，血管形成得以減弱。圖 27B是在各條件下對閉合單元形成的定量（用內(nèi)皮祖細胞至少一式三份并且重復進行）的 一系列圖。
[0068] 圖28A-B是說明本發(fā)明的復合人抗體變體在三陰性乳癌的人原位異種移植物 模型中的功能性驗證的一系列圖示和圖解表示。在人三陰性乳癌的體內(nèi)模型中使用 MDA-MB-231細胞系，評估本發(fā)明的復合人抗體變體（來自表2)對整聯(lián)蛋白β 1亞單位的功 能性抑制。圖28Α是根據(jù)時間顯示組腫瘤平均體積的圖。圖28Β是蛋白質印跡的圖像。 [0069]圖29是說明本發(fā)明的復合人抗體變體在自三陰性乳癌的自發(fā)性肺轉移的人原位 異種移植物模型中的功能性驗證的一系列圖示表示。
[0070] 圖30A-C是說明本發(fā)明的復合人抗體變體在胰腺癌的人異種移植物模型中的功 能性驗證的一系列圖示和圖解表示。在人吉西他濱（g