纖蛋白蛋白變體及相應的核酸序列的制作方法
【專利說明】纖蛋白蛋白變體及相應的核酸序列
[0001] 本申請要求于2013年4月2日提交的美國臨時專利申請序列號61/807445的權 益，并在此通過引用將其整體并入。 發(fā)明領域
[0002] 本發(fā)明的實施提供纖蛋白3(也稱為含EGF的纖蛋白樣胞外基質蛋白1 (EFEMP1)) 的多肽的變體，和其編碼的核苷酸序列，其特征在于抑制癌細胞生長，抑制癌細胞侵襲，以 及抑制癌癥復發(fā)的一種或多種抗癌功能。
[0003]發(fā)明背景
[0004] 纖蛋白屬于分泌糖蛋白，有七種類型。其共同特點是擁有多個類表皮生長因子 (EGF)模塊和一個獨特的C端模塊。研究纖蛋白對癌癥的功能表明，一些類型的纖蛋白具有 抑癌活性，也有一些具有致癌活性。此外，一些類型的纖蛋白（如纖蛋白3/EFEMP1)即有腫 瘤抑制活性也有致癌活性，取決于具體細胞組織特性。
[0005] EFEMP1腫瘤抑制功能列舉如下。EFEMP1具有通過抑制內(nèi)皮細胞出芽而達到的抗 新血管生成作用。EFEMP1過高表達有抑制纖維肉瘤細胞成瘤的功能。EFEMP1過低表達和 /或EFEMP1啟動子甲基化在肺癌，肝癌，乳腺癌，結腸癌，前列腺癌和鼻咽癌中普片發(fā)生。 EFEMP1在膠母細胞瘤，肝癌和鼻咽癌中的表達與預后有良好的正相關性。在鼻咽癌和膠母 細胞瘤的細胞系中，EFEMP1抑制AKT信號通路傳導。
[0006] EFEMP1致癌功能列舉如下。EFEMP1在子宮頸癌，乳房癌中過高表達和不良預后相 關。在胰腺癌細胞，EFEMP1過度表達促進其異種成瘤并激活AKT信號通路傳導。在某些神 經(jīng)膠質瘤細胞，EFEMP1增強體外底物特異性的細胞粘附并促進細胞運動性和侵襲性。
[0007] 膠母細胞瘤（GBM)是一致命的原發(fā)性腦腫瘤。目前還沒有任何有效的治療。其不 同亞群細胞具有不同的增殖和侵襲能力。盡管經(jīng)過手術，放療和化療，絕大多數(shù)GBM會復 發(fā)。復發(fā)的機理尚未確定。據(jù)推測，復發(fā)源于GBM中一群具有神經(jīng)干細胞特性的細胞亞群 (所謂的腫瘤干細胞），有強的侵襲性并耐輻射和化療。GBM生長似乎在很大程度上依賴于 新血管增生的腫瘤微環(huán)境。抗新血管增生的療法已顯示出暫時抑制的GBM腫瘤生長的療 效。但抗血管增生療法不能延長GBM患者的存活時間，復發(fā)的腫瘤有腫瘤侵襲增強的征兆。 此前，靶向治療神經(jīng)膠質瘤細胞侵襲有所欠缺。 發(fā)明概要
[0008] 在過去的30年中，GBM癌癥患者手術后增加伴隨替莫唑胺治療，放射治療，其生存 期中位數(shù)只增加了 2. 5個月。本發(fā)明的目的是提供一種癌癥療法，通過抑制癌細胞的生長， 侵襲，和/或癌癥復發(fā)，例如治療GBM。因此，本發(fā)明實施例提供了 EFEMP1變體，特征為在 腫瘤細胞中通過調(diào)節(jié)一些蛋白的活性和/或表達水平，包括表皮生長因子受體（EGFR)及 AKT，蛋白質酪氨酸激酶2 (PTK2)，和NOTCH。該癌癥可以是低到中等級別膠質瘤，高級別膠 質瘤，如GBM，纖維肉瘤，結腸直腸癌，肺癌，結腸癌，肝癌，乳腺癌，前列腺癌，或鼻咽癌。并且 癌癥細胞可以是腫瘤干細胞和非干細胞樣癌細胞。
[0009] 本發(fā)明的某些實施例提供的多肽：（i )包含其氨基酸序列共享至少約70%，約 75%，約 80%，約 85%，約 90%，約 95%，約 97%，約 99%，或 100%與在 SEQ ID N0 :1 所顯 示的氨基酸序列相同；和（ii )具備至少一種抗癌行為，包括抑制癌細胞侵襲，腫瘤生長，和 癌癥復發(fā)。本發(fā)明的一些實施例包括提供對于這樣的多肽進行編碼的核苷酸序列的核酸分 子。
[0010] 本發(fā)明的某些實施例提供的多肽：（i )包含其氨基酸序列共享至少約85%，約 90%，約95%，約97%，約99%，或100%與在SEQ ID N0 :1或SEQ ID N0 :2所顯示的氨基 酸序列相同，和（ii )具備至少一種抗癌行為，包括抑制EGFR表達，抑制EGFR活性，抑制 AKT表達，抑制Akt活性，抑制PKT2表達，抑制PKT2活性，抑制NOTCH表達，和抑制NOTCH活 性。本發(fā)明的一些實施例提供了對于這樣的多肽進行編碼的核苷酸序列的核酸分子。
【附圖說明】
[0011] 圖1A是人的纖蛋白組成員的Clustal W氨基酸序列的比對，包括EFEMP1，EFEMP2 和纖蛋白5(FBLN5)。圖1B是比較人，小鼠，和大鼠的EFEMP1的EGFR同源區(qū)域（EHR)氨基 酸序列，以及相應的人的4個EGFR亞型和EGFR缺失突變體中EHR的氨基酸序列。
[0012] 圖 2 是 EFEMP1，F(xiàn)LAG 標記 EFEMP1 (E1)及其蛋白變體（E2-E11，E13-E15, E18)的 蛋白模塊化結構的概略。
[0013] 圖3A是腫瘤重量曲線圖，來自例4中所述的皮下（SC)異種移植實驗，由皮下注入 U251細胞株⑵及由p⑶NA 3. 1質粒載體穩(wěn)定轉化株，如圖2和例1所述，表達FLAG標記 的EFEMP1及其變體（E1-E3, E6-E7, E10-E11，E13, E15)。圖3B是腫瘤重量曲線圖，來自例 4中所述的SC異種移植實驗，由皮下注入U251細胞株，穩(wěn)定轉染了如圖2和例1中所述 中描述的慢病毒PTRIPZ空載體（Vec)及表達FLAG標記EFEMP1及其變體（E1-E3, E6-E7， E10-E11，E13, E15)〇
[0014] 圖4A是transwell底部表面的照片，來自例5中描述的基質膠細胞侵襲測定實 驗，用U251細胞株（P)及由p⑶NA 3. 1質粒載體穩(wěn)定轉化株，如圖2和例1所述，表達E1， E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10, Ell，E13, E14, E15 和 E18,以及空載體 pcDNA 3. 1+ (Vec)。 圖4B是一個細胞侵襲性圖，來自例5中描述的基質膠侵襲測定實驗，用U251神經(jīng)球細胞株 (U251-NS)，及由pTRIPZ慢病毒穩(wěn)定轉染株，如圖2和例2所述，表達El，E2, E3, E5, E7， E8, E10, Ell，E13, E15和E18,以及空載體pTRIPZ (Vec).圖4C是例6中所述的兩組明膠酶 譜照片，樣本來自圖4B基質膠侵襲測定實驗的細胞分泌到基本培養(yǎng)液中的蛋白。
[0015] 圖5是一組免疫印跡照片，來自例7中所描述分析U251細胞株⑵及其穩(wěn)定轉染 株的免疫印跡實驗，轉染株來自細胞感染了如圖2和例1所述的E1，E2，E5和ElOpTRIPZ慢 病毒。
[0016] 圖6是裸鼠生存曲線圖。來自例8中所述的顱內(nèi)（1C)異種移植實驗，顱內(nèi)注入 U251神經(jīng)球培養(yǎng)的細胞（U251-NS)及其穩(wěn)定轉染株，用如圖2和例1中所述中描述的慢病 毒pTRIPZ空載體（Vec)及表達FLAG標記EFEMP1 (E1)及其變體（E2, E5)。
[0017] 本發(fā)明的詳細描述
[0018] 通過本發(fā)明的實施目的在于提供一 EFEMP1變體的氨基酸序列，該蛋白具備抑制 癌癥的功效，如在神經(jīng)膠質瘤（例如，多形膠質母細胞瘤）中，表現(xiàn)至少一種如下功能：抑制 活性癌細胞生長，抑制癌細胞侵襲，抑制癌復發(fā)。在本發(fā)明的描述中，氨基酸序列的EFEMP1 變體在某些地方被稱為EFEMP1衍生腫瘤抑制蛋白（ETSP)，分別和共同抑制神經(jīng)膠質瘤各 亞群細胞的增殖和侵襲及異種移植腫瘤原位生長。ETSP的發(fā)現(xiàn)，至少部分，通過EFEMP1氨 基酸序列同源性研究及用功能實驗手段研究各個EFEMP1變體在神經(jīng)膠質瘤腫瘤各亞群細 胞表達的結果。
[0019] 圖1A是人的纖蛋白組成員的Clustal W氨基酸序列比較，包括EFEMP1，EFEMP2 和纖蛋白5 (FBLN5)。這表明，雖然EFEMP1的蛋白序列比EFEMP2和FBLN5都長，它們的序 列相似程度很高。圖1A還分別顯示EFEMP1和FBLN5的弱（RGE)和強（R⑶）的整聯(lián)蛋白 (Integrin)結合位點的位置。圖1B是CLUSTAL W氨基酸序列比較，比較一段EFEMP1上由 38個氨基酸組成的EGFR同源區(qū)域（EHR)。參與比較的氨基酸序列包括：人，小鼠，和大鼠 EFEMP1中的EHR;4個人類表皮生長因子受體（EGFRvl，EGFRv2, EGFRv3, EGFRv4)亞型；和 在癌細胞中發(fā)現(xiàn)的EGFR缺失突變體（EGFRvIII)。
[0020] 圖2是蛋白模塊化結構的概略，描述EFEMP1，F(xiàn)LAG標記的EFEMP1及其變體 (E1-E11，E13-E15,和E18)的蛋白結構。構建體E1編碼具有野生型全長EFEMP1的氨基酸 序列，它包括一個信號肽，一個DSL模塊，一帶有插入的EGF樣模塊，五個編號1-5的EGF樣 模塊，和一個纖蛋白型模塊。
[0021] 構建體E2編碼其中的氨基酸81-172已被刪除的一個EFEMP1變體，在很大程度上 消除了 EFEMP1特異的有插入的EGF樣模塊。
[0022] 構建體E3編碼其中的氨基酸379-493已被刪除的一個EFEMP1變體，在很大程度 上消除了 EFEMP1的纖蛋白型模塊。
[0023] 構建體E4編碼一個EFEMP1變體，其中氨基酸186已經(jīng)從丙氨酸轉變?yōu)楦拾彼?，?EFEMP1的弱的整聯(lián)蛋白結合位點轉換成一個強的結合位點。
[0024] 構建體E5編碼其中氨基酸379-493被刪除的一個EFEMP1變體，基本上消除了 EFEMP1的纖蛋白型模塊，并且將其中氨基酸210從谷氨酸轉變?yōu)樘於彼?，相應將EFEMP1 的一個弱的整聯(lián)蛋白結合位點轉換成一個強的結合位點。
[0025] 構建體E6編碼其中氨基酸173-213和379-493被刪除的一個EFEMP1變體，在很 大程度上消除了第一個EGF樣模塊和EFEMP1的纖蛋白型模塊。
[0026] 構建體E7編碼其中氨基酸173-213被刪除一個EFEMP1變體，基本上消除了 EFEMP1的第一個EGF樣模塊。
[0027] 構建體E8編碼其中氨基酸379-493被刪除一個EFEMP1