一種小分子化合物在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體設(shè)及一種新型小分子化合物在制備抗肺癌藥物中 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康與生活質(zhì)量的主要原因之一。肺癌是最常見(jiàn) 的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)肺癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)，尤其是在中國(guó)等 發(fā)展中國(guó)家。在我國(guó)，隨著工業(yè)化速度加快、環(huán)境污染加重、人口老齡化加劇，肺癌的患病率 W及致死率日益加重。因此，尋找治療肺癌的有效方法已經(jīng)成為目前最為迫切的任務(wù)之一。
[0003] 肺癌的治療方法包括手術(shù)治療、放射治療、藥物治療等。目前肺癌的治療已從最初 的手術(shù)治療的單一手段發(fā)展到今天的手術(shù)切除、放射治療和內(nèi)科治療為一體的綜合治療模 式。另外，80%的肺癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬于晚期，大多患者仍W藥物治療為主。鑒于傳統(tǒng)藥 物嚴(yán)重的毒副作用W及耐藥性等問(wèn)題，研究開(kāi)發(fā)新的高效、腫瘤特異性W及毒副作用小的 藥物成為治療肺癌的主攻方向之一。
[0004] 近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)對(duì)生命和腫瘤研究的不斷深入，針對(duì)特定生理過(guò)程和祀 點(diǎn)的分子祀向藥物W其獨(dú)特的療效和遠(yuǎn)大的前景在肺癌治療中引起了廣泛關(guān)注。化學(xué)合成 的有機(jī)小分子是一種分子量小、容易進(jìn)入細(xì)胞、可W與其中的蛋白質(zhì)分子結(jié)合并影響蛋白 活性的一種化合物。在抗腫瘤藥物的篩選中，活性化合物可被視為一種藥物先導(dǎo)化合物，為 后續(xù)進(jìn)行的結(jié)構(gòu)修飾、藥理學(xué)研究、藥代動(dòng)力學(xué)分析等奠定基礎(chǔ)。除此之外，還可W進(jìn)一步 尋找活性化合物的作用祀點(diǎn)及作用機(jī)制，從而為藥物研發(fā)提供新的祀點(diǎn)。
[0005] 細(xì)胞調(diào)亡是程序性細(xì)胞死亡的一種形式之一，是細(xì)胞一種生理性、主動(dòng)性的細(xì)胞 "自殺行為"，是一個(gè)受到一系列相關(guān)基因嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞死亡過(guò)程。調(diào)亡不會(huì)引起后續(xù)的 炎癥等不良反應(yīng)，因此已經(jīng)成為研究抗癌藥物的主要方式之一。不同的調(diào)亡信號(hào)在細(xì)胞中 引發(fā)不同的調(diào)亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。根據(jù)調(diào)亡信號(hào)的來(lái)源可W將細(xì)胞調(diào)亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分成兩 條：外源性通路(死亡受體通路）和內(nèi)源性通路(線粒體通路)。
[0006] 線粒體是細(xì)胞調(diào)亡調(diào)控的活動(dòng)中屯、。當(dāng)受到細(xì)胞調(diào)亡信號(hào)刺激。線粒體釋放細(xì)胞 色素C至細(xì)胞漿中。細(xì)胞色素C與細(xì)胞內(nèi)存在的一種調(diào)亡細(xì)胞蛋白酶激活因子（Apoptosis ProteaseActivatingFactor-LApaf-l)結(jié)合，在dATP存在的條件下，通過(guò)半脫氨酸蛋白 酶募集域的作用，Apaf-1和化spase-9酶原結(jié)合。使化spase-9酶原活化，然后激活下游 的效應(yīng)半脫氨酸蛋白酶如化spase-3、6,7等成員，從而啟動(dòng)細(xì)胞調(diào)亡。
[0007]Caspase全稱(chēng)為含半脫氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cystein^aspartate specificproteinase)。該家族是直接導(dǎo)致調(diào)亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，在細(xì)胞調(diào)亡機(jī) 制網(wǎng)絡(luò)中居中屯、地位，是一組在細(xì)胞調(diào)亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用的酶。Caspase家族在誘 導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的分子機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，是多條調(diào)亡通路的匯聚點(diǎn)，是執(zhí)行調(diào)亡的最終途 徑。Caspass-3是迄今為止研究比較透徹的一個(gè)，它是主要的效應(yīng)者分子。其中化spase-3 被認(rèn)為是調(diào)亡的關(guān)鍵蛋白酶，一旦被激活，即發(fā)生下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使調(diào)亡不可避免，因而 Caspase-3被稱(chēng)為"死亡蛋白酶"。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供了一種小分子化合物在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明 通過(guò)藥理藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，該小分子化合物對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞具有顯著 的抑制增殖、誘導(dǎo)調(diào)亡等作用。
[0009] 本發(fā)明所述的小分子化合物如下： 8-[巧）-2-[(4-bromophenyl)methy1idene]hydrazin-1-yl]-3-methyl-7- (2-phen oxyethyl)-2, 3, 6, 7-tetr曰hy化o-lH-purine-2, 6-dione(貝勾自LifeChemicalsSmall MoleculesCollection公司）； 化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
中文名稱(chēng)為：8-[巧)-2-[ (4-漠苯基）亞甲基]聯(lián)氨-1-基]-3-甲基-7- (2-苯氧乙 基）-2, 3, 6, 7-四氨-1H-嚷嶺-2, 6-二酬。
[0010] 本發(fā)明所述小分子化合物在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用；其中肺癌細(xì)胞為非小細(xì)胞 肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞。
[0011] M1T法檢測(cè)該小分子化合物能有效抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞存活率ICw濃 度為 4. 945 ±0.402yM。
[0012] 化echst 33342染色結(jié)果顯示，該小分子化合物可W使A549細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)生明 顯的核皺縮現(xiàn)象。
[0013] 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，該小分子化合物對(duì)A549細(xì)胞具有明顯的誘導(dǎo)調(diào)亡作用。
[0014] 用JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位的結(jié)果顯示，該小分子化合物可W使A549細(xì)胞的 線粒體膜電位顯著降低，即通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞的調(diào)亡。
[0015] Caspase水平分析結(jié)果顯示，該小分子化合物可W顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞內(nèi)化spase 3/7的活性，即該小分子化合物通過(guò)caspase 3/7依賴(lài)型途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞的調(diào)亡。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為M1T法檢測(cè)該小分子化合物對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用結(jié)果； 圖2為流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DMS0對(duì)A549細(xì)胞調(diào)亡的影響結(jié)果； 圖3為流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)2. 5 y M的該小分子化合物對(duì)A549細(xì)胞調(diào)亡的影響結(jié)果； 圖4為流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)5 y M的該小分子化合物對(duì)A549細(xì)胞調(diào)亡的影響結(jié)果； 圖5為流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)10 y M的該小分子化合物對(duì)A549細(xì)胞調(diào)亡的影響結(jié)果； 圖6為線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1)檢測(cè)該小分子化合物誘導(dǎo)A549細(xì)胞線粒體膜 電位的變化情況（*沖<0. 01)結(jié)果； 圖7為化spase-Glo? 3/7 Assay (Promega)檢測(cè)該小分子化合物處理的A549細(xì)胞中Caspase 3/7活性的變化情況結(jié)果（*沖<0. 01)。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于所述 內(nèi)容，實(shí)施例中方法如無(wú)特殊說(shuō)明均采用常規(guī)方法，使用試如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)市售試 劑或采用常規(guī)方法配置的試劑。
[0018] 實(shí)施例1 :通過(guò)M1T法檢測(cè)該小分子化合物對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響，實(shí)驗(yàn)步驟 如下： (1) 取膜酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5 X 104cell/ml， 加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 y1細(xì)胞懸液，然后放入37°C的細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱 的C〇2濃度為5%，培養(yǎng)2地； (2) 該小分子化合物的原溶液濃度為10ml,用DMS0進(jìn)行濃度梯度稀釋?zhuān)瑵舛忍荻?為10yM、5yM、2. 5yM、1.25yM，每個(gè)梯度每孔加入lyl，設(shè)S個(gè)復(fù)孔，補(bǔ)充100 RPMI-1640培養(yǎng)液；同時(shí)設(shè)置加入1y1 0. 5%DMS0為對(duì)照組，繼續(xù)放入培