基于上轉(zhuǎn)換的新型光控活細(xì)胞染色方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒的光控染料釋放并對活細(xì)胞進(jìn)行革E1向著色 的新方法，屬生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞染色技術(shù)是生命科學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和診斷學(xué)等領(lǐng)域非常重要的科研和臨床診斷 的手段之一。但是在活細(xì)胞中，普通染料（如羅丹明和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚等）很難 通過細(xì)胞膜，使得活細(xì)胞的著色非常困難，所以傳統(tǒng)細(xì)胞染色過程中，常常需要先用甲醛、 丙酮等化學(xué)試劑將細(xì)胞固定，再用染料對細(xì)胞進(jìn)行著色，這些化學(xué)試劑通常會破壞細(xì)胞 膜，這一過程也就導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡，無法實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞的生理狀態(tài)的觀察。
[0003] 目前，雖然在細(xì)胞染色過程中也出現(xiàn)了一些新型的活細(xì)胞染色試劑，可以順利穿 透細(xì)胞膜（比如鈣黃綠素）來實(shí)現(xiàn)對活細(xì)胞的著色，但這些染料在釋放時(shí)也常存在"著色時(shí) 間和劑量不可控，半衰期短，無細(xì)胞特異性，無法對完整生物體進(jìn)行著色"等缺陷，導(dǎo)致在細(xì) 胞染色時(shí)常需要將組織塊或者細(xì)胞群落分散成游離的單個(gè)細(xì)胞，再對其進(jìn)行著色。這種染 色方法對細(xì)胞著色無特異性，無法區(qū)分出正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，并且只能對細(xì)胞進(jìn)行一次 染色，而對分裂、增殖細(xì)胞的染色效果不理想。因此研制新型的活細(xì)胞染色技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對活 細(xì)胞乃至活體特異部位著色的新型染色技術(shù)具有重要的科研和臨床應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的不足，我們提出新型染料技術(shù)，主要集中于如何有效向活細(xì)胞中 投遞任意染料，并實(shí)現(xiàn)染料的定位定量釋放。
[0005] 具體技術(shù)方案如下：
[0006] 本發(fā)明的基于上轉(zhuǎn)換的光控活細(xì)胞染色方法；步驟如下：
[0007] 1)利用納米級染料載體系統(tǒng)，將細(xì)胞漿染料或者細(xì)胞核染料包裹進(jìn)入納米顆粒的 介孔中成為一個(gè)染料庫；
[0008] 2)利用染料載體系統(tǒng)表面的靶向修飾功能，通過主動靶向作用將染料輸送到所需 細(xì)胞和組織；
[0009] 3)利用納米顆粒中的上轉(zhuǎn)換核心作為光源轉(zhuǎn)換器，將近紅外光轉(zhuǎn)換成原位的紫外 光和可見光，位于納米載體表面的大量光感分子在紫外光和可見光的驅(qū)動下構(gòu)象發(fā)生反復(fù) 變化，從而促進(jìn)分子馬達(dá)的運(yùn)轉(zhuǎn)。本發(fā)明便可以通過控制近紅外光的照射部位和時(shí)間來選 擇性地將納米顆粒內(nèi)的有機(jī)染料釋放出來，最終實(shí)現(xiàn)靶向細(xì)胞的可控制性著色。
[0010] 所述的納米顆粒；其包括稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒子核；核外包裹介孔二氧化娃殼 層；殼層表面修飾光敏分子偶氮苯及祀向葉酸分子。
[0011] 本發(fā)明所述的納米顆粒制備方法，步驟如下：
[0012] (1)按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為氯化釔：氯化鐿：氯化銩=(500~750) : (150~250) :0· 3 將原料加入到反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中加入溶劑水使上述物質(zhì)完全溶解；在磁力攪拌條 件，加熱至沸騰，直至稀土鹽溶液變成白色固體；
[0013] (2)水蒸干后，冷卻至60~80°C，按照體積比為油酸：十八烯=2~3:1將二者加 入反應(yīng)器中使白色固體完全溶解；
[0014] (3)按照質(zhì)量數(shù)為NaOH:氟化銨=1~6 :3將二者加入的反應(yīng)器中加入甲醇使 其完全溶解，氟化銨與上述氯化銩的質(zhì)量比=3:1 ;調(diào)節(jié)溫度升溫到120~150°C，抽真空 30~50min，通氬氣；迅速升溫到260~300°C，維持反應(yīng)1~3h;結(jié)束后加入丙酮離心純 化，真空干燥處理后得到稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒。
[0015] 所述的包裹介孔二氧化硅殼層的制備方法：采用公開的常津，王漢杰等發(fā)明（公 開號：CN104771756A)，化療用稀土上轉(zhuǎn)換光控藥物釋放納米制劑及其制備方法：
[0016] (1)取稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒：十六烷基三甲基溴化銨：氫氧化鈉=1:(50~200): (5~20)將原料加入到反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中加入水使上述物質(zhì)完全溶解，磁力攪拌 條件下加熱到50~80°C，攪拌1~2h;
[0017] (2)然后加入正硅酸乙酯，其中正硅酸乙酯與稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒的質(zhì)量比= 0.01~0.5:1;反應(yīng)1~2h后，離心純化；
[0018] (3)將（2)中的顆粒分散到乙醇中，加入氯化鈉作為除模板劑，其中氯化鈉與顆粒 的質(zhì)量比=10~50 :1，磁力攪拌條件下加熱到50~80°C，攪拌3~9h;反應(yīng)完全后離心 純化，產(chǎn)物真空干燥處理后得到介孔硅殼層包覆的上轉(zhuǎn)換納米顆粒。
[0019] 本發(fā)明所述的殼層表面修飾光敏分子偶氮苯及靶向葉酸分子的方法，步驟如下：
[0020] ⑴按照物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為4-苯偶氮苯甲酰氯：葉酸：3_氨丙基三乙氧基硅烷 =1:(1~50):(1~6)將原料加入到反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中加入溶劑二甲基亞砜將上 述物質(zhì)完全溶解，避光條件下攪拌5~10h;
[0021] (2)接著加入按照質(zhì)量份數(shù)比碳二亞胺：N-羥基琥珀酰亞胺=0· 4:0. 4~0· 8,其 中碳二亞胺與4-苯偶氮苯甲酰氯的質(zhì)量份數(shù)比為0. 4 :1，繼續(xù)攪拌3~9h后離心純化，得 到表面修飾光敏分子偶氮苯及靶向葉酸分子殼層。
[0022] 本發(fā)明所述納米顆粒裝載有機(jī)染料的步驟如下：
[0023] (1)按照物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為上轉(zhuǎn)換納米納米顆粒：有機(jī)染料=1~10:1加入到 反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)器中加入二甲基亞砜溶劑將上述物質(zhì)完全分散；
[0024] (2)在磁力攪拌條件下，攪拌6~12h，然后離心純化，最終得到上轉(zhuǎn)換光控染料釋 放的納米載體，產(chǎn)物真空干燥處理，得到顆粒尺寸為80~150nm的納米載體。
[0025] 本發(fā)明所述基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒的染色方法，步驟如下：
[0026] 1)將制備好的上轉(zhuǎn)換光控納米染料載體顆粒與待染色活細(xì)胞共培養(yǎng)0.5~2h;
[0027] 2)當(dāng)納米染料載體在靶向分子葉酸的作用下特異性地聚集到腫瘤部位后，給予具 有組織穿透性的近紅外激光照射；
[0028] 3)穿透深部組織的激光被上轉(zhuǎn)換納米核捕獲，在該部位產(chǎn)生相應(yīng)的紫外光和可見 光；
[0029] 4)紫外光和可見光被納米載體表面的光敏小分子偶氮苯吸收后，其構(gòu)象發(fā)生反復(fù) 變化，促進(jìn)分子馬達(dá)運(yùn)轉(zhuǎn)，從而控制染料的釋放。
[0030] 上述步驟中稱取物質(zhì)的質(zhì)量為毫克級（mg)，稱取的體積為毫升級（ml)。
[0031] 本發(fā)明提供了一種上轉(zhuǎn)換光控染料釋放納米載體的制備方法。如圖3所示，其主 要涉及三個(gè)部分內(nèi)容即1)稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒的合成；2)稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒包覆介孔 硅殼層及表面光敏分子和靶向分子的修飾以及有機(jī)染料的包埋。組裝得到的稀土上轉(zhuǎn)換光 控染料釋放的納米載體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，粒徑均一，具有靶向定位，光控釋放等優(yōu)點(diǎn)。
[0032] 本發(fā)明首先，如圖4透射電鏡測試結(jié)果顯示，利用溶劑熱法制備稀土上轉(zhuǎn)換納米 顆粒（A)粒徑小于50nm，粒度分布均勾，制備的稀土上轉(zhuǎn)換光控染料釋放納米顆粒（B)粒 徑小于l〇〇nm，粒度分布均勾。如圖5焚光發(fā)射光譜分析所示，制備的稀土上轉(zhuǎn)換納米載體 顆粒能夠在近紅外光照射下，發(fā)出多重顏色的光如紫外光和藍(lán)光等。如圖6明場及暗場條 件下照片顯示，上轉(zhuǎn)換納米載體的宏觀照片（A)和近紅外照射條件下的熒光照片（B)。如 圖7進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備的上轉(zhuǎn)換納米載體的細(xì)胞毒性非常低。如圖8裝載 有DAPI細(xì)胞核染料的納米載體對人宮頸癌細(xì)胞（Hela細(xì)胞）進(jìn)行著色，當(dāng)給予近紅外光照 射以后細(xì)胞的著色效果更加明顯（C圖）。
[0033] 二、本發(fā)明的有益效果：
[0034] 1)本發(fā)明涉及的稀土上轉(zhuǎn)換光控染料釋放納米載體系統(tǒng)的主要優(yōu)勢包括：操作 簡便，適用性強(qiáng)，成本低，在水中具有較好的分散性，能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)染料在腫瘤組織處的定 時(shí)、定量和定位釋放。
[0035] 2)本發(fā)明涉及的稀土上轉(zhuǎn)換光控染料釋放的納米載體的主要性能指標(biāo)包括：a) 有效粒徑在80~150nm之間，粒徑更均勻，且可以根據(jù)載體的組成成分，實(shí)驗(yàn)條件等進(jìn)行調(diào) 節(jié)；b)穩(wěn)定性好，可在水溶液中保存至少2個(gè)月以上；c)表面含有大量靶向分子葉酸，易于 載體在腫瘤組織處的聚集；d)整個(gè)制備過程簡單快捷，制備周期短，產(chǎn)率高，適合大批量生 產(chǎn)。
[0036] 本發(fā)明同傳統(tǒng)的化療載體相比具有如下優(yōu)勢：

【附圖說明】
[0038] 圖1 :稀土上轉(zhuǎn)換納米載體吸收近紅外光轉(zhuǎn)換為紫外光和可見光的并激活偶氮苯 分子馬達(dá)啟動的作用機(jī)理圖。
[0039] 圖2 :上轉(zhuǎn)換納米載體光控染料釋放的作用機(jī)理圖。
[0040] 圖3 :上轉(zhuǎn)換光控染料釋放納米載體的制備方法流程圖。
[0041] 圖4:按照實(shí)施例1合成的稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒（A)和按照