一種包埋有凝血相關(guān)酶水凝膠微球的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水凝膠微球的應(yīng)用，特別是一種包埋有凝血相關(guān)酶的水凝膠微球 在血液凝固中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前公開的針對(duì)血液（或血漿）凝固的方法均是采用凝血相關(guān)酶的直接凝固，這 種方法僅適用于少量靜態(tài)樣品或比較細(xì)小的管路的凝結(jié)。但如果是直徑很大的管腔體系， 且有正壓推進(jìn)的情況下，難以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)流動(dòng)態(tài)的血液（或血漿）的快速凝固以及目 標(biāo)管腔的有效封堵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明將凝血酶的生化促凝活性與水凝膠微球的阻塞作用相結(jié) 合，提出一種包埋有凝血相關(guān)酶的水凝膠微球在凝血過程的應(yīng)用。其特征在于：水凝膠微 球的主要成分是海藻酸鹽材料，微球粒徑100-1000微米，粒徑均一（CV〈20 % )，含有凝血相 關(guān)酶的海藻酸鈉水凝膠微球中凝血相關(guān)酶與海藻酸鈉的質(zhì)量比1:3-4:1，除水后凝血相關(guān) 酶的載藥量在25% -80%，載有凝血相關(guān)酶的水凝膠微球用于下述三種情形之一或二種以 上；
[0004] A、含有纖維蛋白原液體于管路中流動(dòng)過程的管路阻塞；
[0005] 或，B、含有纖維蛋白原液體于管路中流動(dòng)過程的一個(gè)或二個(gè)以上管路開口端封 閉；
[0006] 或，C、含有纖維蛋白原液體的凝結(jié)。
[0007] 其中，所述含有纖維蛋白原的液體包括離體的血液或血漿。
[0008] 所述流動(dòng)的含有纖維蛋白原液體管路的阻塞、開口端封閉及液體凝結(jié)包括物 理-化學(xué)的聯(lián)合作用；
[0009] 物理作用包括微球的機(jī)械阻塞和水凝膠迅速吸水膨脹后加強(qiáng)阻塞封閉作用；化學(xué) 作用指凝血相關(guān)酶作用于纖維蛋白原引發(fā)液體凝固后帶來的阻塞封閉及凝結(jié)效應(yīng)。
[0010] 所述水凝膠微球尤其適用于在一定壓力（60-150mmHg)存在的含有纖維蛋白原的 流動(dòng)液體的管路阻塞、管路開口端封閉或液體凝結(jié)的情形之一或二種以上。
[0011] 所述水凝膠微球中的凝血相關(guān)酶，包括凝血酶或血凝酶中的一種或兩種。
[0012] 所述海藻酸鹽水凝膠微球中，海藻酸鹽分子量10kDa-2000kDa，所述海藻酸鹽包括 海藻酸鈣鹽或海藻酸鋇鹽中的一種或二種，也可同時(shí)包含或不包含海藻酸鈉鹽或鉀鹽中的 一種或二種。
[0013] 所述水凝膠微球的制備方法包括如下步驟：
[0014] A、配制濃度10_30g/L海藻酸鈉溶液；
[0015] B、將凝血相關(guān)酶溶解到步驟A制備的海藻酸鈉溶液中，凝血相關(guān)酶的濃度為 10-40g/L，即得含有凝血相關(guān)酶的海藻酸鈉溶液；
[0016] C、配制凝膠浴水溶液，凝膠浴中含有總濃度5_30g/L氯化鈣或氯化鋇的一種或兩 種，凝膠浴水溶液還含有總濃度l_20g/L氯化鈉或氯化鉀中的一種或二種；凝膠浴水溶液 還含有總濃度〇. 5-20g/L檸檬酸鈉或磷酸鈉或磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉中的一種或二種 以上；凝膠浴水溶液還含有總濃度l-30g/L吐溫或F68中的一種或二種；
[0017] D、在高壓靜電場(chǎng)下，將步驟B配制的含有凝血相關(guān)酶的海藻酸鈉溶液形成均勻的 射流液滴，液滴進(jìn)入步驟C配制的凝膠浴溶液中，發(fā)生凝膠化反應(yīng)，即得包埋有凝血相關(guān)酶 的海藻酸鹽水凝膠微球。
[0018] 所述包埋有凝血相關(guān)酶的海藻酸鹽水凝膠微球可進(jìn)一步與聚陽(yáng)離子溶液交聯(lián)反 應(yīng)，在微球表面形成聚電解質(zhì)絡(luò)合膜，形成包埋有凝血相關(guān)酶的海藻酸鹽-聚陽(yáng)離子微球， 具體步驟為：
[0019] 1)將包埋有凝血相關(guān)酶的海藻酸鹽水凝膠微球投入到聚陽(yáng)離子溶液中，微球與聚 陽(yáng)離子溶液的體積比為1:2-1:10,旋轉(zhuǎn)震蕩，讓微球在溶液中處于均勻懸浮狀態(tài)，進(jìn)行聚電 解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)2-60分鐘；
[0020] 2)微球與聚陽(yáng)離子反應(yīng)液分離，收集微球，生理鹽水清洗后即獲得包埋有凝血相 關(guān)酶的海藻酸鹽-聚陽(yáng)離子微球；
[0021] 其中，聚陽(yáng)離子包括殼聚糖及其衍生物，α或ε聚賴氨酸，聚鳥氨酸、聚精氨酸， 聚胺及其衍生物、聚酰胺及其衍生物、聚酰亞胺及其衍生物，及上述任一一種或二種以上聚 陽(yáng)離子的共聚物中的一種或二種以上，聚陽(yáng)離子分子的分子量在lkDa-500kDa，聚陽(yáng)離子溶 液濃度 〇· 2_20g/L。
[0022] 所述包埋有凝血相關(guān)酶的水凝膠微球可根據(jù)應(yīng)用需求，實(shí)現(xiàn)凝血相關(guān)酶在應(yīng)用環(huán) 境的緩控釋。
[0023] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0024] 1.載凝血酶的海藻酸鹽水凝膠微球用于流動(dòng)的含有纖維蛋白原液體管路的阻塞、 開口端封閉及液體凝結(jié)。較單純凝膠微球或單純凝血酶的作用效果相比，本發(fā)明發(fā)揮了水 凝膠微球的物理效應(yīng)及凝血酶的化學(xué)效應(yīng)相聯(lián)合的作用。其中，物理效應(yīng)包括微球的機(jī)械 阻塞和水凝膠迅速吸水膨脹后加強(qiáng)阻塞封閉作用；化學(xué)作用指凝血相關(guān)酶作用于纖維蛋白 原引發(fā)液體凝固后帶來的阻塞封閉及凝結(jié)效應(yīng)。因此，本發(fā)明中的載有凝血酶的海藻酸鹽 水凝膠微球能夠充分發(fā)揮對(duì)流動(dòng)的含有纖維蛋白原液體管路的阻塞、開口端封閉及液體凝 結(jié)的應(yīng)用效果。
[0025] 2.由于能夠?qū)崿F(xiàn)體外緩釋。因此，將凝血酶的生化促凝血功能與海藻酸鹽水凝膠 微球的物理阻塞作用相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)在一定壓力（60-150mmHg)存在的含有纖維蛋白原的流 動(dòng)液體的管路阻塞、開口端封閉及液體凝結(jié)。
[0026] 3.本發(fā)明的工藝制備過程條件溫和，易于凝血相關(guān)酶生物活性的保持。
[0027] 4.本發(fā)明采用的凝血相關(guān)酶包埋工藝，是在海藻酸鹽水凝膠微球制備過程中直 接將凝血相關(guān)酶包埋進(jìn)微球，凝血相關(guān)酶的包封率高達(dá)90%以上，除水后的載藥量高到 25% -80%。
【附圖說明】
[0028] 附圖1 :新西蘭大白兔腎動(dòng)脈造模及微球栓塞影像；
[0029] A:正常腎臟影像；
[0030] B:腎臟血管損傷造模后影像（紅色箭頭所示為損傷后出血）；
[0031] C:利用微球栓塞受損動(dòng)脈后影像，顯示出血停止；
[0032] D:栓塞后lOmin復(fù)查血管造影顯示無出血，凝血酶微球栓塞止血成功。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 【1】配制海藻酸鈉溶液（濃度15g/L);
[0035] 【2】將凝血酶（lOOmg)溶解到步驟【1】制備的海藻酸鈉溶液中，濃度為10g/L，即 得含有凝血酶的海藻酸鈉溶液；
[0036] 【3】配制凝膠浴溶液，凝膠浴中含有氯化鈣（濃度30g/L)，氯化鈉（濃度5g/L)，磷 酸二氫鈉（濃度lg/L)，吐溫5g/L ;
[0037] 【4】在高壓靜電場(chǎng)下，將步驟【2】配制的含有凝血酶的海藻酸鈉溶液形成均勻的射 流液滴，液滴進(jìn)入步驟【3】配制的凝膠浴溶液中，發(fā)生凝膠化反應(yīng)，反應(yīng)30分鐘后即得包埋 有凝血酶的海藻酸鹽水凝膠微球，微球粒徑500± 100微米。
[0038] 【5】將步驟【4】制備的包埋有凝血酶的海藻酸鹽水凝膠微球，與殼聚糖溶液（濃 度5g/L)常溫下進(jìn)行成膜反應(yīng)10分鐘，生理鹽水洗滌3遍，即獲得包埋有凝血酶的海藻酸 鹽-殼聚糖微球。
[0039] 【6】配制纖維蛋白原溶液：取纖維蛋白原，加入0. 9 %氯化鈉溶液制備成含lg/L的 溶液。
[0040] 【7】通過微加工技術(shù)制備一分二、二分四的三級(jí)分枝的管路，最后一級(jí)形成長(zhǎng)lcm， 直徑:φ =2mm的4條并聯(lián)管路，管路末端開放，與儲(chǔ)液池相連，并通過蠕動(dòng)泵將儲(chǔ)液池液體 重新泵回三級(jí)分枝管路中一級(jí)管路加樣入口，形成循環(huán)回路。將步驟【6】配制的纖維蛋白 原溶液放在儲(chǔ)液池中，即在蠕動(dòng)泵作用下，以i〇ml/s的流速穩(wěn)定通過三級(jí)流動(dòng)管路。
[0041] 【8】將步驟【5】制備的包埋有凝血酶的海藻酸鹽-殼聚糖微球通過毛細(xì)導(dǎo)管（內(nèi) 徑為1mm)導(dǎo)入三級(jí)流動(dòng)管路最后一級(jí)距離開口端5mm處，向流動(dòng)管路中放入0. 2ml微球， 取出導(dǎo)管，發(fā)現(xiàn)放有微球的導(dǎo)管在30秒鐘后即發(fā)生血漿流體凝固，而未放置微球的管路， 仍然保持正常的流動(dòng)狀態(tài)。
[0042] 比較例1
[0043] 【1】配制纖維蛋白原溶液：取纖維蛋白原，加入0. 9 %氯化鈉溶液制備成含lg/L的 溶液。
[0044] 【2】與實(shí)施例1相同方法加工成相同的三級(jí)分枝管路。
[0045] 【3】將與實(shí)施例1等量的凝血酶溶液通過毛細(xì)導(dǎo)管（內(nèi)徑為1mm)導(dǎo)入三級(jí)流動(dòng)管 路最后一級(jí)距離開口端5_處，取出導(dǎo)管，發(fā)現(xiàn)30秒鐘后各導(dǎo)管均未發(fā)生凝固反應(yīng)，仍然保 持正常