融合混合物的制作方法
【專利說(shuō)明】融合混合物
[0001]本發(fā)明涉及用于在體內(nèi)或者在體外修飾任意脂膜、細(xì)胞膜、細(xì)胞膜組成部分或者與細(xì)胞其余組成部分分離的細(xì)胞膜的含脂質(zhì)的膜的融合混合物，以及涉及通過(guò)與該混合物融合修飾含脂質(zhì)的膜的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]對(duì)于治療用途而言，存在著對(duì)將藥學(xué)活性物質(zhì)引入到目標(biāo)細(xì)胞中的方法的需求。
[0003]由 Khalil 等人(1.A.Khalil,K.Kogure,H.Akita,H.Harashima, 2006.UptakePathways and Subsequent Intracellular Trafficking in Nonviral Gene Delivery.PHARMACOLOGICAL REVIEWS，第58卷，第1期，32-45)已知，對(duì)于DNS可區(qū)分為胞吞和非胞吞吸收方法。在科學(xué)界中根據(jù)該評(píng)論文章認(rèn)為，DNS的主要吸收方式借助脂質(zhì)復(fù)合體(Lipoplexen)(也稱為陽(yáng)離子脂質(zhì)-DNA復(fù)合體)以胞吞方式進(jìn)行。細(xì)胞外大分子的囊泡吸收稱為胞吞。據(jù)此，直至1990年代中期認(rèn)為的在脂質(zhì)復(fù)合體的脂質(zhì)與細(xì)胞膜融合之后的大分子的直接吸收不能再站得住腳，而最多以極小比例參與。
[0004]Friend等人的論文為該假設(shè)提供了證據(jù)，其中通過(guò)電子顯微照片展示了胞吞之后囊泡中的 DNS (Friend DS，Papahadjopoulos D 和 Debs RJ (1996) Endocytosisand intracellular processing accompanying transfect1n mediated by cat1nicliposomes.B1chim B1phys Acta 1278:41 - 50)。該吸收方式由 Wei jun和 Szoka Jr.證明(Weijun Li和Francis C.Szoka Jr.2007.Lipid-based Nanoparticles for NucleicAcid Delivery.Pharmaceutical Research，24，438-449)。
[0005]陽(yáng)離子脂質(zhì)可以用于制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體。已知由這些起始成分形成陽(yáng)離子脂質(zhì)體難于控制，因?yàn)橛蛇@些起始物質(zhì)可能形成不同的結(jié)構(gòu)。因此，將陽(yáng)離子脂質(zhì)與作為所謂的輔助物脂質(zhì)的中性脂質(zhì)預(yù)先均勻地混合以形成脂質(zhì)體，因?yàn)閮H陽(yáng)離子脂質(zhì)明顯不能夠確保形成脂質(zhì)體。如由上述Khalil等人的文獻(xiàn)已知(Khalil等人，第40頁(yè)，右欄，第一段)，例如使用DOPE或者膽留醇作為輔助物。
[0006]該輔助物脂質(zhì)例如具有親水性區(qū)域以及有或沒有雙鍵的疏水性區(qū)域(尤其C10-C30)o兩種區(qū)域均具有中性性質(zhì)。由此，中和了分子種類A的帶正電的分子之間的大的電荷密度和排斥力。該作用導(dǎo)致該體系的穩(wěn)定。因此，使用輔助物脂質(zhì)是必需的，并且此外提高了該體系的轉(zhuǎn)染效果。所述輔助物脂質(zhì)的比例設(shè)定為直至最大70%重量/重量。合適的分子例如是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿(1，2- 二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺、1，2- 二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺、1，2- 二肉豆蔻?；?sn_甘油基-3-磷酰乙醇胺、1，2-二-十八稀?；?Dielaidoyl)-sn-甘油基_3_磷酰乙醇胺、1，2-植燒醇甘油基-3-磷酰乙醇胺、1，2-二亞油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺或者1，2_ 二油?；鵢sn_甘油基-3-磷脂酰膽喊)。
[0007]具有中性輔助物脂質(zhì)的帶正電的融合混合物例如從W0 2011/003406 A2中已知。所公開的融合混合物在每種情況中基于由分子種類A (陽(yáng)離子脂質(zhì))、分子種類B (熒光標(biāo)記物)和分子種類C，即中性輔助物脂質(zhì)構(gòu)成的一種具體組成。在此，脂質(zhì)體與在附著在細(xì)胞上的細(xì)胞膜及其質(zhì)膜融合，其中建議分子種類A:B:C的比例為1:0.1:1重量/重量。
[0008]由 Csiszcir 等人(Csiszcir A.等人Novel Fusogenic Liposomes for FluorescentCell Labeling and Membrane Modificat1n, B1conjugate Chemistry，2010，21，537-543)已知融合的脂質(zhì)體體系，其由陽(yáng)離子的(分子種類A)、中性的(分子種類C)和芳族脂質(zhì)(分子種類B)構(gòu)成，并且其中分子種類A:B:C以1:0.1:1重量/重量的比例存在。使用D0TAP作為分子種類A，熒光親脂性分子如Di0、DiR、氟硼二吡咯-、麗絲胺_羅丹明_和FITC-標(biāo)記的脂質(zhì)作為分子種類B。使用DOPE作為輔助物脂質(zhì)C。該混合物用于構(gòu)建脂質(zhì)體，并且此外用于熒光細(xì)胞標(biāo)記、蛋白質(zhì)嵌入、細(xì)胞膜功能化、活性物質(zhì)吸收、DNA-吸收等。作者特別地表示，僅這3種組分的協(xié)同相互作用產(chǎn)生有效融合的混合物。
[0009]Kleusch 等人(Kleusch Ch.等人 Fluorescent lipids: funct1nal parts offusogenic liposomes and tools for cell membrane labeling and visualizat1n,1016(311168，2011，16，221-250)同樣公開了分子種類厶:8:〇以1/0.1/1重量/重量比例的陽(yáng)離子脂質(zhì)體體系，其中兩種焚光分子(分子種類B)具有兩種連續(xù)的(aufeinanderfolgend)功能。首先，一種生物上不重要的熒光組分促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)膜和融合脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層之間的快速的細(xì)胞融合，該融合脂質(zhì)體包含中性(細(xì)胞種類C)和帶正電的(細(xì)胞種類A)脂質(zhì)。在嵌入到細(xì)胞膜中之后，可以通過(guò)確定第二種熒光組分的量來(lái)進(jìn)行細(xì)胞膜和/或在該處進(jìn)行的傳輸過(guò)程的熒光展示。該融合脂質(zhì)體體系因此具有四種組分(細(xì)胞種類A、細(xì)胞種類C和兩種細(xì)胞種類B)，并且類似于Csiszcir等人或者在W0 2011/003406中的3元體系，僅以精確給定和固定的相互比例來(lái)公開。
[0010]因此，由現(xiàn)有技術(shù)已知的融合混合物的缺點(diǎn)是分子種類A、B和C狹窄的濃度范圍以及為了獲得有效融合的混合物，至少3種組分的協(xié)同相互作用。
[0011]發(fā)明目的
本發(fā)明的目的是，由少量分子種類提供易于組成的融合混合物，其用于在體內(nèi)或者在體外修飾任意脂膜、細(xì)胞膜、細(xì)胞膜的組成部分或者與細(xì)胞其余組成部分分離的細(xì)胞膜的含脂質(zhì)的膜。該融合混合物應(yīng)與任意脂膜融合。該融合混合物的組成部分尤其應(yīng)可以在相對(duì)大的濃度范圍中彼此存在，以能夠根據(jù)細(xì)胞膜的類型和所用的融合混合物的成分來(lái)快速和有效地實(shí)施融合。
[0012]進(jìn)一步地，該融合混合物應(yīng)能容易地制備。
[0013]此外，本發(fā)明的目的是提供用于與該融合混合物有效地進(jìn)行膜融合的方法。
_4] 達(dá)成目的的方法
用根據(jù)專利權(quán)利要求1的融合混合物和根據(jù)專利權(quán)利要求6的方法實(shí)現(xiàn)所述目的。對(duì)此有利的實(shí)施方案由各自的從屬專利權(quán)利要求獲悉。
_5]發(fā)明描述
用于在體內(nèi)或者在體外修飾任意脂膜例如細(xì)胞膜、細(xì)胞膜的組成部分或者與細(xì)胞其余組成部分分離的細(xì)胞膜的含脂質(zhì)的膜的融合混合物包含帶正電的兩親性分子A和為芳族分子的分子B。在此，分子種類A和B以1:0.02至1:2摩爾/摩爾的比例存在。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)和迄今的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)相反，令人驚奇地已認(rèn)識(shí)到，中性輔助物脂質(zhì)形式的分子種類C對(duì)于可重復(fù)和有效地獲得融合混合物與任意脂膜的融合而言不是必需的。
[0017]分子種類A和分子種類B在本發(fā)明的融合混合物中以1:0.02至1:2摩爾/摩爾的A:B比例存在。優(yōu)選地存在1:0.05至1:1摩爾/摩爾的A:B比例。該混合摩爾比相比于已知的混合比而言是令人驚奇得寬的。
[0018]有利地，根據(jù)本發(fā)明的融合混合物可以存在于水性懸浮體中。
[0019]在本發(fā)明的范圍內(nèi)看出并且借助實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，可以以給出的A:B比例范圍在不存在其它脂質(zhì)組分的情況下實(shí)施可重復(fù)的膜融合。
[0020]令人驚奇地已認(rèn)識(shí)到，融合的充足條件是所給出的比例的兩親性分子A和芳族化合物B。
[0021]在本發(fā)明的融合混合物的情況中有利的是，其可以比根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的混合物更容易制備，因?yàn)楦鶕?jù)現(xiàn)有技術(shù)的混合物包含至少三種分子種類。
[0022]借助在給出的范圍中選擇兩種分子種類A和B特別有利地導(dǎo)致能夠?qū)嵤┛芍貜?fù)的膜融合，更確切地說(shuō)無(wú)論何種物質(zhì)均可借助該融合混合物引入到細(xì)胞上或者細(xì)胞中。在此，在該融合混合物與任意脂膜或其組成部分或其片段接觸之后快速地，即在幾分鐘內(nèi)進(jìn)行融合。該融合可以在體內(nèi)或者在體外實(shí)施。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的融合混合物可以補(bǔ)充至少一種添加劑Z，例如:
1.合成的脂質(zhì)分子和脂質(zhì)混合物，
2.天然的脂質(zhì)分子或脂質(zhì)混合物，
3.細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)和跨U旲蛋白質(zhì)，
4.蛋白質(zhì)-脂質(zhì)-混合物，
5.不同的核酸(例如DNA、siRNA)，
6.各種納米顆粒(磁性的、熒光的等)，
7.用藥學(xué)活性物質(zhì)或者其它的化學(xué)或者生物物質(zhì)。
[0024]在此應(yīng)注意，附加的組分Z的比例通常不應(yīng)超過(guò)所述融合混合物的46摩爾％。根據(jù)添加劑Z的種類和所基于的具有A和B的融合混合物，Z當(dāng)然能夠具有1至46摩爾％的所有可能的中間值。根據(jù)應(yīng)用目的，還可以在根據(jù)本發(fā)明的融合混合物中存在多種不同的添加劑。
[0025]如果將多種添加劑ΖΡ..Ζη添加到融合混合物中，則這些Zl...Ζη通常也具有最大46摩爾％的總比例。
[0026]本發(fā)明的融合混合物既可以在與合成模型膜(囊泡)融合時(shí)使用，也可以用于與細(xì)胞膜，包括質(zhì)膜或者細(xì)胞細(xì)胞器膜及其組成部分或者片段融合。
[0027]這樣融合的膜顆?？梢杂欣剡€具有融合性能，從而使其能夠用于與其它膜進(jìn)一步融合?？梢匀绺髯缘?中間_)產(chǎn)物的融合性能已知的那樣經(jīng)常地重復(fù)這樣的融合。
[0028]可以在懸浮體中或者在貼壁膜的表面上實(shí)施所述融合。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的帶正電的融合混合物以1:0.02至1:2摩爾/摩爾的A:Β比例含有分子種類Α和B。分子種類B在此可以取對(duì)分子種類A的各個(gè)中間值，即以1:0.02、1:0.03、1:0.04