鵝膏毒肽衍生物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤治療。一方面，本發(fā)明涉及鵝膏毒肽和靶結(jié)合基團(tuán)例如抗體通過 特定接頭連接的共輒物，用于治療癌癥和其他病癥及疾病。另一方面，本發(fā)明涉及包括所述 共輒物的藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 鵝膏毒肽是8個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽。例如，它們可以從鵝膏蕈蘑菇分離或合成制 備。鵝膏毒肽特異性地抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNA依賴性RNA聚合酶II，從而抑制受影響的 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的生物合成。細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄抑制導(dǎo)致生長和增殖的停止。雖然不是共價(jià) 連接，鵝膏毒肽和RNA聚合酶II能夠緊密的連接（KD= 3nM)。因?yàn)閺拿根Z膏蕈堿的解離是 一個(gè)非常緩慢的過程，所以受影響的細(xì)胞恢復(fù)的可能性不大。當(dāng)轉(zhuǎn)錄的抑制時(shí)間過長，細(xì)胞 將經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡（凋亡）。
[0003] 在1981年，通過使用連接到色氨酸的吲哚環(huán)的接頭（氨基酸4;參見圖1)，經(jīng)重 氮化，連接抗Thyl. 2抗體到α-鵝膏蕈，已經(jīng)探討了用鵝膏毒肽作為細(xì)胞毒性基團(tuán)用于腫 瘤治療（Davis&Preston,Science1981，213, 1385-1388)。Davis和Preston確定連接位點(diǎn) 7'。Morris和Venton證明位點(diǎn)7'的替代導(dǎo)致保持細(xì)胞毒性的衍生（Morris&Venton,Int. J.PeptideProteinRes1983,21 419-430)〇
[0004] 專利申請(qǐng)EP1859811Al(2007年11月28日公布）中描述的共輒物，其中，β鵝 膏蕈堿的鵝膏毒肽氨基酸1的yc-原子直接，即不通過接頭結(jié)構(gòu)，連接到白蛋白或單克隆 抗體ΗΕΑ125,0ΚΤ3,或PA-1。此外，示出了這些共輒物對(duì)乳腺癌細(xì)胞（MCF-7)、Burkitt淋巴 瘤細(xì)胞（Raji細(xì)胞）和T-淋巴瘤細(xì)胞（Jurkat細(xì)胞）增殖的抑制效果。其提示了接頭的 使用，包括這樣的接頭，所述接頭包括例如酰胺，酯，醚，硫醚，二硫化物，脲，硫脲，烴基等元 素，但其沒有實(shí)際示出這樣的構(gòu)建體，也沒有提供更多的細(xì)節(jié)，如鵝膏毒肽的附著位點(diǎn)。
[0005]專利申請(qǐng)W0 2010/115629 和W0 2010/115630(均 2010 年 10 月 14 日公布）描述 的共輒物，其中抗體，如抗EpCAM抗體諸如人源化huHEA125,通過（i)所述鵝膏毒肽氨基酸 1的γC-原子（ii)所述鵝膏毒肽氨基酸4的6'C-原子，或（iii)通過δC原子鵝膏毒肽 氨基酸3的δC-原子連接到鵝膏毒肽，在每一種情況下可以直接或通過抗體和鵝膏毒肽之 間的接頭連接。提示的接頭包含例如酯，醚，氨基甲酸酯，肽鍵等元素。此外，示出了這些共 輒物對(duì)乳腺癌細(xì)胞（細(xì)胞系MCF-7)，胰癌（細(xì)胞系CAPAN-1)，結(jié)腸癌（細(xì)胞系的C〇1〇205) 和膽管癌（細(xì)胞系0Z)增殖的抑制作用。
[0006]Wieland審查了 鶴膏毒肽的構(gòu)效關(guān)系（T.Wieland,PeptidesofPoisonous AmanitaMushrooms,Springerseriesinmolecularbiology,SpringerVerlagNew York，1986)。假定氨基酸2的羥基基團(tuán)（羥基脯氨酸）和氨基酸3所述-羥基基團(tuán)（二羥 基-異亮氨酸）為活性所必需，而在氨基酸1 (天冬氨酸或天冬酰胺）、氨基酸4 (6-羥基色 氨酸）的功能基團(tuán)和氨基酸3的-羥基基團(tuán)更耐受化學(xué)修飾。這表明，后者是接頭附著的 首選位點(diǎn)，而應(yīng)避免前者的修飾。
[0007] 已知的是，當(dāng)連接到大生物分子的載體時(shí)，鵝膏毒肽是相對(duì)無毒的，，如抗體分 子，而且它們只有在切掉生物分子載體后才發(fā)揮它們的細(xì)胞毒性。鑒于鵝膏毒肽的毒性， 特別是對(duì)肝細(xì)胞，最為重要的是，對(duì)用于靶向腫瘤治療的該鵝膏毒肽共輒物施用等離子體 后，它保持高度穩(wěn)定，并且在靶細(xì)胞內(nèi)化后發(fā)生鵝膏毒肽的釋放。在這種情況下，共輒穩(wěn)定 的微小改進(jìn)可對(duì)治療窗和鵝膏毒肽共輒物治療方法的安全性產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。
[0008] 發(fā)明目的
[0009] 本發(fā)明目的是進(jìn)一步提供在血漿中穩(wěn)定的靶結(jié)合基團(tuán)鵝膏毒肽共輒物，以最小化 對(duì)非靶細(xì)胞的有害副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明基于以下意外的發(fā)現(xiàn)：兩個(gè)氧原子與鵝膏毒肽氨基酸3的γ和sc原 子連接形成的環(huán)可以提高靶結(jié)合基團(tuán)鵝膏毒肽共輒物耐受性，而不會(huì)干擾鵝膏毒肽與它 們的目標(biāo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNA依賴性RNA聚合酶II相互作用。至今認(rèn)為羥基基團(tuán)與鵝膏 毒肽氨基酸3的γ和SC原子的連接對(duì)鵝膏毒肽和鵝膏毒肽共輒物的功效是至關(guān)重要 的。Wieland(Τ.Wieland,PeptidesofPoisonousAmanitaMushrooms,SpringerSeries inMolecularBiology,SpringerVerlagNewYork, 1986；ffielandT，RempelD，Gebert U,BukuA,BoehringerH.TJbordieInhaltsstoffedesgrlinenKliollenblatterpiizes, XXXII.ChromatographischeAuftrennungderGesamtgifteundIsolierungderneuen NebentoxineAmaninundPhallisinsowiedesungiftigenAmanullins.LiebigsAnn Chem. 1967 ;704:226 - 236)認(rèn)為天然產(chǎn)生的缺少γ-羥基的鵝膏毒肽毒性顯著降低，如一 羥鵝膏毒素酰胺。
[0011] 一方面，本發(fā)明涉及式I的鵝膏毒肽
[0012]
[0013] 其中：
[0014] R1選自C= 0,C=S，C=NR6和CR7Rs;
[0015] R2選自S= 0,S02和S;
[0016] R3選自NHR5和OR5;
[0017] R4選自H，OR5,和OC! 6_ 烷基；
[0018] R6選自Ci6_亞烷基-R5,亞環(huán)烷基-R5,雜亞環(huán)烷基-R5,亞芳基-R5,和雜亞芳 基-R5;
[0019] R7和Rs獨(dú)立地選自H，C16-亞烷基-R5,亞環(huán)烷基-R5,雜亞環(huán)烷基-R5,亞芳基-R5， 和雜亞芳基-R5;
[0020] 其中：
[0021] ⑴每個(gè)R5是H;
[0022] (ii)R5中的一個(gè)是-Ln_X，其中L是接頭，η選自0和1，X是可與靶向基團(tuán)連接的 化學(xué)基團(tuán)，并且其余的R5為Η;或
[0023] (iii)R5中的一個(gè)是-Ln-X*-Y，其中L是接頭，η選自0和1，Υ是靶向基團(tuán)，X*是 X與Υ的官能團(tuán)連接產(chǎn)生的化學(xué)部分，并且其余的R5是Η。
[0024] 另一方面，本發(fā)明涉及用作藥物的鵝膏毒肽。
[0025] 又一方面，本發(fā)明涉及用于治療患者中的癌癥的鵝膏毒肽，其中所述癌癥選自乳 腺癌，胃腸道癌，例如組成的組中結(jié)腸直腸癌，胰腺癌，膽管癌，肝細(xì)胞癌，骨肉瘤，肺癌，前 列腺癌，鱗狀細(xì)胞癌，卵巢癌，睪丸癌，膀胱癌，胃癌，頭頸癌，宮頸癌，腎癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，皮 膚癌，如：惡性黑色素瘤，甲狀腺癌，白血病，惡性淋巴瘤。
[0026] 又一方面，本發(fā)明涉及藥物共輒物，根據(jù)本發(fā)明，其包含的鵝膏毒肽還包括一種或 多種藥學(xué)上可用的稀釋劑，載體，賦形劑，填充劑，粘合劑，潤滑劑，助流劑，崩解劑，吸附劑； 和/或防腐劑。
[0027] 又一方面，本發(fā)明涉及一種方法，用于合成本發(fā)明的鵝膏毒肽，其包括以下步驟： 將式II的鵝膏毒肽
[0028]
[0029] 其中：
[0030] R2選自S= 0,SO2和S;
[0031] R3選自NHR5和OR5;
[0032] R4選自H，OR5,和OQ6_ 烷基；
[0033] R6選自Ci6_亞烷基-R5,亞環(huán)烷基-R5,雜亞環(huán)烷基-R5,亞芳基-R5,和雜亞芳 基-R5;
[0034] R7和R8獨(dú)立地選自H，Ci6_亞烷基-R5,亞環(huán)烷基-R5,雜亞環(huán)烷基-R5,亞芳基-R5， 和雜亞芳基-R5;
[0035] 其中R5之一是H，R5中的一個(gè)是-Ln_X，其中L是接頭，η選自0和1，X是可與靶 向基團(tuán)連接的化學(xué)基團(tuán)，并且其余的R5為Η;或者R5中的一個(gè)是-Ln-X*-Y，其中L是接頭， η選自0和1，Y是靶向基團(tuán)，X*是X與Y的官能團(tuán)連接產(chǎn)生的化學(xué)基團(tuán)，并且其余的R5是 Η；
[0036] 與以下反應(yīng)：（i)N，Ν' -二琥珀酰亞胺碳酸酯（DSC)，（ii)硫羰化試劑，特別是硫， 1，1'-硫羰基二咪唑或1，1'-硫代羰基-2 (1H)-吡啶酮；（iii)氨基羰基試劑，特別是胩的 二氯化物或異硫氰酸苯；或（iv)醛，酮或無環(huán)縮醛。
【附圖說明】
[0037] 圖1示出了不同的鵝膏毒肽的結(jié)構(gòu)式。粗體數(shù)字（1至8)表示形成鵝膏毒肽的八 種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)。同時(shí)示出了氨基酸1，3和4中原子的標(biāo)準(zhǔn)名稱（分別是從希臘字母 α到γ，希臘字母α到δ，和從Γ到7'，）。
[0038] 圖2示出了細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，BrdU檢測(cè)中不同鵝膏毒肽-曲妥單抗（商品名 赫賽汀）共輒物對(duì)SK-0V-3 (卵巢癌）細(xì)胞的毒性。
[0039] 圖3示出了細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，BrdU檢測(cè)中不同鵝膏毒肽-曲妥單抗共輒物對(duì) SK-0V-3(卵巢癌）細(xì)胞的細(xì)胞毒素活性。
[0040] 圖4示出了細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，BrdU檢測(cè)中不同鵝膏毒肽-曲妥單抗共輒物對(duì) SKBR-3(乳腺癌）細(xì)胞的細(xì)胞毒素活性。
[0041] 圖5示出了細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，BrdU檢測(cè)中不同鵝膏毒肽-曲妥單抗共輒物對(duì) JIMT-1 (乳腺癌）細(xì)胞的細(xì)胞毒素活性。
[0042] 圖6示出了乳腺癌異種移植模型中兩種不同的鵝膏毒肽-曲妥珠單抗共輒物的體 內(nèi)效力。
[0043] 圖7示出了雌性NMRInu/nu小鼠中兩種不同的鵝膏毒肽-曲妥珠單抗共輒物的 體內(nèi)耐受性。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 通過參考本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】和包括在其中的實(shí)施例，可以更容易地理解本 發(fā)明。
[0045] 一方面，本發(fā)明涉及式I的鵝膏毒肽。
[0046]
[0047] 其中：
[0048] R1選自C= 0,C=S，C=NR6和CR7Rs;
[0049] R2選自S= 0,SO2和S;
[0050] R3選自NHR5和OR5;
[0051] R4選自H，OR5,和 0C! 6_ 烷基；
[0052] R6選自Ci6_亞烷基-R5,亞環(huán)烷基-R5,雜亞環(huán)烷基-R5,亞芳基-R5,和雜亞芳 基-R5;
[0053] R7和R8獨(dú)立地選自H，Ci6_亞烷基-R5,亞環(huán)烷基-R5,雜亞環(huán)烷基-R5,亞芳基-R5， 和雜亞芳基-R5;
[0054] 其中：
[0055] ⑴每個(gè)R5是Η;
[0056] (ii)R5中的一個(gè)是-Ln_X，其中L是接頭，η選自0和1，Χ是可與靶向基團(tuán)連接的 化學(xué)基團(tuán)，并且其余的R5為Η;或
[0057] (iii)R5中的一個(gè)是-Ln-X*_Y，其中L是接頭，η選自0和1，Υ是靶向基團(tuán)，X*是 X與Υ的官能團(tuán)連接產(chǎn)生的化學(xué)部分，并且其余的R5是Η。
[0058] 術(shù)語"靶結(jié)合基團(tuán)"，如本文所用，是指可以特異性結(jié)合到靶分子或靶表位的任何 分子或分子集團(tuán)。本申請(qǐng)的上下文中首選靶結(jié)合基團(tuán)是（i)抗體或抗原結(jié)合片段；（ii)抗 體樣蛋白；和（iii)核酸適體。適于本發(fā)明使用的"靶結(jié)合基團(tuán)"典型的具有40000Da(40kDa 的）或更高的分子量。
[0059] 如本文所用，如果它的解離常數(shù)KD達(dá)到所述100μΜ或更少，優(yōu)選50μΜ或更少， 優(yōu)選30μΜ或更少，優(yōu)選20μΜ或更少，優(yōu)選10μΜ或更少，優(yōu)選為5μΜ或更少，更優(yōu)選1μΜ 或更少，更優(yōu)選為900ηΜ或更少，更優(yōu)選為800ηΜ或更少，更優(yōu)選為700ηΜ或更少，更優(yōu)選為 600ηΜ或更少，更優(yōu)選500ηΜ或更少，更優(yōu)選為400ηΜ或更少，更優(yōu)選為300ηΜ或更少，更優(yōu) 選為200ηΜ或少，甚至更優(yōu)選ΙΟΟηΜ或更少，甚至更優(yōu)選90ηΜ或更少，甚至更優(yōu)選為80ηΜ或 更少，甚至更優(yōu)選為70ηΜ或更少，甚至更優(yōu)選為60ηΜ或更少，甚至更優(yōu)選50ηΜ以下，甚至 更優(yōu)選40ηΜ或更少，甚至更優(yōu)選為30ηΜ或更少，甚至更優(yōu)選20ηΜ或更少，甚至更優(yōu)選ΙΟηΜ 或更少的的第二化合物，則認(rèn)為第一化合物（例如抗體）是"特異地結(jié)合"至第二化合物 (例如抗原，如靶蛋白）。
[0060] 本申請(qǐng)的上下文中，術(shù)語"靶分子"和"靶表位"分別指的是分別由特定靶結(jié)合基 團(tuán)結(jié)合的抗原和抗原表位。優(yōu)選的靶分子是腫瘤相關(guān)抗原，特別是存在于一種或多種腫瘤 細(xì)胞類型或腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面上的抗原或表位，相比于非腫瘤細(xì)胞表面，它有更高的濃度 和/或不同的立體構(gòu)。優(yōu)選地，所述抗原