熒光固體脂質(zhì)納米顆粒組合物及其制備
【專利說(shuō)明】熒光固體脂質(zhì)納米顆粒組合物及其制備
[0001] 本發(fā)明涉及藥學(xué)和診斷組合物領(lǐng)域，特別涉及包含熒光探針的組合物，更特別涉 及包含所述探針的固體脂質(zhì)納米顆粒。
[0002] 本發(fā)明還涉及儀器診斷學(xué)，特別是實(shí)時(shí)成像引導(dǎo)手術(shù)的領(lǐng)域。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 吲哚菁綠（本文中也稱為ICG)是經(jīng)FDA批準(zhǔn)的熒光探針，但是遭受快的代謝清 除，因?yàn)槠渫ㄟ^(guò)肝臟快速排除。已知的是在靜脈內(nèi)注射之后，ICG結(jié)合至白蛋白并且隨后 幾乎僅被肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞攝取。當(dāng)以〇. 5mg/kg的人推薦劑量施用ICG時(shí)，正常的血液半衰期 為大約 3.0 分鐘（RosenthalE，ZinnKR編輯，OpticalImagingofCancer:Clinical Applications.NewYork,NY,USA:Springer;2009 年，第 72 頁(yè)）。該有效的肝膽排泄防止了 ICG在特定病理部位的選擇性積累，限制了其可能的臨床應(yīng)用，所述應(yīng)用實(shí)際上主要被局限 于在眼部血管造影術(shù)，肝功能表征，或心輸出量的測(cè)量方面的應(yīng)用的血流的光學(xué)檢查。
[0005] 吲哚菁綠被認(rèn)為是在臨床上熒光成像應(yīng)用方面高靈敏度腫瘤檢測(cè)和淋巴結(jié)的顯 像的有希望的候選物。尤其希望的是在手術(shù)切除病灶或內(nèi)窺鏡手術(shù)治療期間用于癌的病灶 和前哨淋巴結(jié)檢測(cè)的實(shí)時(shí)可視化的ICG的制劑。
[0006] 然而，如以上所述，由于其在人血液中的非常低的停留時(shí)間，當(dāng)以0. 5mg/kg的臨 床推薦劑量使用時(shí)，ICG在靜脈內(nèi)施用之后不具有在腫瘤組織處的任何明顯靶向性質(zhì)。
[0007] 此外，ICG在水溶液中不穩(wěn)定（已經(jīng)在μΜ濃度），并且由于其聚集傾向而必 須在6小時(shí)內(nèi)使用。染料-染料相互作用隨著消光系數(shù)的降低和染料激發(fā)后的熒光 自猝滅效應(yīng)而對(duì)ICG的光學(xué)性質(zhì)有不良影響（Landsman，M.L. ;Kwant，G. ;Mook，G.Α.; Zijlstra,ff.G.Lightabsorbingproperties,stability,andspectralstabilization ofindocyaninegreen.J.Appl.Physiol. 1976, 40, 575 - 83).
[0008]SaxenaV.等人（JournalofPhotochemistryandPhotobiologyB:Biology 74 (2004) 29-39)公開(kāi)了用于改進(jìn)ICG的水穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性的聚（DL-乳酸共乙 醇酸）和聚乙烯醇聚合物型納米顆粒。在該工作中，即使負(fù)載ICG的納米顆粒的穩(wěn)定性由 于將ICG包埋于聚合物包囊中而得以改進(jìn)（在水溶液中顯示2. 5-3天的半衰期），但是呈納 米顆粒的ICG就游離的ICG溶液而言仍顯示出在其峰值熒光強(qiáng)度方面的降低。該發(fā)現(xiàn)連同 高粒度分布（平均直徑約350nm)可能導(dǎo)致在腫瘤靶向的體內(nèi)成像方面的低效率。
[0009] W02010/018216公開(kāi)了ICG吲哚菁綠的熒光納米乳液，其在油相ICG中包含至少一 種兩親性脂質(zhì)和至少一種在25°C為固體的增溶性脂質(zhì)。根據(jù)該文獻(xiàn)，納米乳液中的液滴應(yīng) 當(dāng)具有無(wú)定型核芯，因?yàn)榻Y(jié)晶性被認(rèn)為對(duì)有利于將經(jīng)包封的分子排出至液滴或它們的聚集 體外部的納米乳液穩(wěn)定性不利。
[0010] 盡管通過(guò)上述納米顆粒和納米乳液提供了明顯的進(jìn)步，但將ICG用于近紅外成像 仍遇到問(wèn)題。Altino含III和Adair(WIREsNanomedicineandNanobiotechnology，第二卷， 2010年九月/十月，461-477)證實(shí)了量子點(diǎn)（QD)在NIR成像中優(yōu)異的光學(xué)和穩(wěn)定性性質(zhì)。 然而，毒性問(wèn)題阻礙了它們的使用并且仍建議NIR染料。回顧了ICG在由磷酸鈣合成的納 米顆粒中的包封，并且盡管相對(duì)于QD的性能較低，但仍建議其臨床應(yīng)用。
[0011]Zheng等人（Mol.Pharmaceutics2011，8, 447-456)，為 了克服ICG的差的水穩(wěn) 定性、其非特異性結(jié)合至蛋白質(zhì)和缺乏靶向特異性的問(wèn)題，公開(kāi)了利用磷脂-聚乙二醇 (PL-PEG)與ICG之間的非共價(jià)自組裝化學(xué)的含ICG的納米結(jié)構(gòu)。建議了該納米結(jié)構(gòu)用于靶 向光學(xué)成像和光熱治療的雙重功能。最近已描述了它們?cè)隗w內(nèi)光熱治療中的用途（Zheng 等人，Mol.Pharm, 2012, 9 (3) : 514-522) ·
[0012] Navarro等人（JournalofBiomedicalNanotechnology，第 8 卷，594-604 和 730-741,2012)公開(kāi)了有利于術(shù)中熒光的ICG的脂質(zhì)納米顆粒向量化（LNP)。在所述工作 中，在至多兩天量化了ICG-LNP與游離染料注射相比的體內(nèi)腫瘤/皮膚和體外腫瘤/肌肉 熒光比例的改進(jìn)（在24和48h之間為2倍）。
[0013]US2006/0083781公開(kāi)了固體脂質(zhì)納米顆粒，其考慮到它們?cè)谀[瘤靶向治療系統(tǒng)， 溫敏凈荷遞送系統(tǒng)，磁驅(qū)動(dòng)靶向系統(tǒng)，治療診斷系統(tǒng)，穩(wěn)定化的油墨組合物和化妝品制劑中 的應(yīng)用而被官能化。此外，可修改所開(kāi)發(fā)的方法以包封脂質(zhì)環(huán)境中的量子點(diǎn)，減少它們對(duì)氧 化性物質(zhì)的可接近性和與Cd相關(guān)的毒性。
[0014]Sawant和Dodiya(RecentPatentsonDrugDelivery&Formulati on2008, 2, 120-135)中提供了對(duì)待用于脂質(zhì)納米顆粒制備的所有方法的現(xiàn)有技術(shù)的 回顧。為了使納米顆粒的遞送性質(zhì)最優(yōu)化，優(yōu)選需要低于l〇〇nm的粒度。相反地，文 獻(xiàn)中所開(kāi)發(fā)的許多方法為SLN提供了微米范圍（Cortesi等人，Biomaterials2002; 23:2283-2294)或不低于 200nm(Garcia-Fuentes等人，ColloidsandSurfaces B:Biointerfaces, 2003, 27:159-168;Morel等人，EuropeanJournalofPharmaceutics andBiopharmaceutics45(1998) 157 - 163)的平均粒度，即遠(yuǎn)高于優(yōu)選的納米尺度范圍。
[0015] 有利地，在本發(fā)明中，納米懸浮液的制劑顯示出低于100nm的粒度且顯示出延長(zhǎng) 的血液循環(huán)半衰期和改進(jìn)的光穩(wěn)定性和熒光信號(hào)。
[0016] 這些不可預(yù)料的結(jié)果通過(guò)最優(yōu)化兩親性組分和制備方法而得以實(shí)現(xiàn)。
[0017] 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0018] 現(xiàn)已不可預(yù)料地發(fā)現(xiàn)，將ICG以及ICG的其它熒光染料類似物連同其它化學(xué)結(jié)構(gòu) 引入固體脂質(zhì)納米顆粒，解決了現(xiàn)有技術(shù)的上述問(wèn)題，還提供了另外的有利之處，其將由本 發(fā)明的以下公開(kāi)而明白可見(jiàn)。
[0019] 本發(fā)明的一個(gè)目的是固體脂質(zhì)納米顆粒（下文也稱為SLN或簡(jiǎn)稱為納米顆粒），其 包括：
[0020] a.固體脂質(zhì)核芯，其包括至少一種甘油酯和/或至少一種脂肪酸；
[0021] b.兩親性組分的混合物；
[0022] c.以具有式I和/或II的化合物的堿土金屬配合物存在的兩親性組分：
[0023]
[0024] 其中，基團(tuán)將在以下說(shuō)明書中定義。
[0025]d.菁家族的焚光染料和/或多雜環(huán)化合物（polyetherocycliccompound)，包括 香豆素、吡喃并、喹啉、吡喃并喹啉、吲哚和吡喃并吲哚衍生物，其呈酸形式，或其藥學(xué)上可 接受的鹽。
[0026] 本發(fā)明的另一目的是用于制備所述納米顆粒的方法。
[0027] 本發(fā)明的另一目的是藥物組合物，其包含上述納米顆粒，尤其是用于診斷。
[0028] 本發(fā)明的另一目的是上述納米顆粒，其用作診斷劑。
[0029] 本發(fā)明的另一目的是上述納米顆粒，其中分子靶向結(jié)構(gòu)部分存在于納米顆粒表面 上，實(shí)現(xiàn)了對(duì)所選擇的靶器官、組織或細(xì)胞的相關(guān)結(jié)合親和力。
[0030] 本發(fā)明的另一目的是上述納米顆粒，其作為診斷劑用于儀器診斷學(xué)中，尤其是實(shí) 時(shí)圖像引導(dǎo)手術(shù)中。
[0031] 本發(fā)明的另一目的是上述納米顆粒，其作為診斷劑用于臨床熒光成像應(yīng)用中的腫 瘤檢測(cè)和淋巴結(jié)的顯像，尤其是在手術(shù)切除病灶或內(nèi)窺鏡/腹腔鏡手術(shù)治療期間用于癌的 病灶和前哨淋巴結(jié)檢測(cè)的實(shí)時(shí)可視化。
[0032]當(dāng)用熒光染料負(fù)載時(shí)，本發(fā)明的SLN隨著在感興趣的病理性組織中隨后的聚集由 于增強(qiáng)的滲透和保留（EPR)效應(yīng)而允許延長(zhǎng)的血液循環(huán)半衰期。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的SLN由于關(guān)于熒光團(tuán)的游離形式的脂質(zhì)基質(zhì)保護(hù)效應(yīng)和改進(jìn)的熒 光信號(hào)而顯示出增強(qiáng)的光穩(wěn)定性。
[0034] 此外，脂質(zhì)組分可以防止染料受取決于與猝滅劑分子的相互作用的降解因素或受 由于臨界生物條件（即酸性pH)的化學(xué)降解或受光暴露（光致褪色過(guò)程）的損害。
[0035] 最后，將熒光染料配制到根據(jù)本發(fā)明的SLN中由于由周圍組分的空間約束產(chǎn)生的 非輻射馳豫速率的降低而改進(jìn)了染料的熒光量子產(chǎn)率（Φ)。
[0036] 這些和其它目的以及有利之處將在以下說(shuō)明書中還借助附圖和實(shí)施例詳細(xì)公開(kāi)。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1展現(xiàn)了本發(fā)明的負(fù)載ICG的SLN的典型粒度分布。
[0038] 圖2展現(xiàn)了ICG和負(fù)載ICG的SLN的光致褪色試驗(yàn)結(jié)果。
[0039] 圖3展現(xiàn)了負(fù)載ICG的SLN的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
[0040] 在圖4中，畫面A展現(xiàn)了負(fù)載ICG的SLN在水溶液中于時(shí)間點(diǎn)為零（虛線）和在 配制120天之后（黑線）的UV-Vis光譜；畫面B顯示了ICG在水溶液中在不同時(shí)間點(diǎn)（時(shí) 間點(diǎn)為零：虛線；9天：灰色線；15天：黑線）的UV-Vis光譜。
[0041] 圖5展現(xiàn)了用于評(píng)價(jià)對(duì)負(fù)載FA-ICG的SLN(靶向的ICG-SLN)的和非靶向 SLN(ICG-SLN)的抗葉酸IgG的結(jié)合親和力的激光干涉法試驗(yàn)。
[0042] 圖6展現(xiàn)了在帶有IGR0V-1異種移植卵巢癌的Balb/Cnu/nu小鼠中在施用負(fù)載 ICG的SLN和負(fù)載FA-ICG的SLN之后24h的小鼠（η= 6)的體外分析。
[0043] 圖7展現(xiàn)了在帶有IGR0V-1異種移植卵巢癌的Balb/Cnu/nu小鼠中在施用 ICG-SLN(畫面A)和FA-ICG-SLN(畫面B)之后24h的兩代表性小鼠的體外分析。
[0044] 圖8展現(xiàn)了靶向的負(fù)載ICG的SLN的光密度（750nm)。
[0045] 圖9展現(xiàn)了實(shí)施例1的負(fù)載ICG的SLN的DSC。
[0046] 圖10顯示了實(shí)施例2的負(fù)載ICG的SLN的DSC曲線。
[0047] 發(fā)明詳述
[0048] 根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒包括以下作為基本組分：
[0049]a)固體脂質(zhì)核芯，其包括至少一種甘油酯和/或至少一種脂肪酸；
[0050]b)形成圍繞所述核芯a)的殼的兩親性組分的混合物；
[0051] c)以具有式I和/或II的化合物的堿土金屬配合物存在的兩親性組分：
[0052]
[0053] 其中基團(tuán)如下文所定義，或其藥學(xué)上可接受的鹽；
[0054]d)菁家族和/或多雜環(huán)化合物的熒光染料，包括香豆素、吡喃并、喹啉、吡喃并喹 啉、吲哚和吡喃并吲哚衍生物，其呈酸形式，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0055] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述納米顆粒還包括：
[0056]e)具有掩蔽劑（stealthagent)功能的共價(jià)連接至所述殼b)的親水性聚合物。
[0057] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述納米顆粒還包括：
[0058]f)分子靶向結(jié)構(gòu)部分，用于特異性結(jié)合至一個(gè)病理學(xué)相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)記物，所述 結(jié)構(gòu)部分連接至所述殼b)或所述親水性聚合物e)。
[0059] 以下百分比組成涉及用于制備SLN的組分a)至f)的量而不考慮最終懸浮液基本 上不含的離子型表面活性劑和低分子量醇的貢獻(xiàn)。
[0060] 在下文，組分a)至f)的每一個(gè)表示為相對(duì)于SLN干組分總重的量的重量/重 量％。
[0061] 固體脂質(zhì)核芯a)包括至少一種甘油酯，優(yōu)選甘油三酯和/或至少一種脂肪酸或 其酯，或其混合物，其至少在室溫（即約20-25Γ)至體溫（37°C)的溫度范圍內(nèi)為固體形 式。在本發(fā)明的第一實(shí)施方案中，所述固體脂質(zhì)核芯a)包括至少一種甘油酯，其選自甘油 單酯、甘油二酯或甘油三酯，具有飽和或不飽和的直鏈或支鏈C12-C24?；?。在甘油二酯和 甘油三酯的情況下，所述?；溈梢韵嗤虿煌?。所述脂肪酸或其酯具有飽和或不飽和的 直鏈或支鏈C12-C24碳鏈。出于本發(fā)明的目的還提供所述脂肪酸的酯，優(yōu)選提供具有C 12-C24 脂肪醇的酯。
[0062] 出于本發(fā)明的目的，"固體脂質(zhì)核芯"意指在室溫（即約20-25Γ)至體溫（即，約 37°C)的溫度為固體的脂質(zhì)核芯。
[0063] 可以占約30-50% (重量/重量），優(yōu)選35-45%的所述固體核芯（本文中也稱 為"脂質(zhì)組分"）包括至少一種甘油酯（選自甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯，具有長(zhǎng)度為 12-24個(gè)碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴鏈，具有大于37°C的熔化溫度）或其混合 物和/或至少一種飽和或不飽和的直鏈或支鏈C12-C24脂肪酸或其酯，條件是所選擇的比例 在上述條件下提供固體組合物。
[0064] 所述脂質(zhì)組分還可以為甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯的混合物，例如以名稱 SOFTISAN?和Witepsol?，優(yōu)選Witepsol?W35、H42、E76、E85 或SOFTISAN? 138、142、154已知的市售混合物。
[0065] 優(yōu)選地，所述脂質(zhì)組分由甘油三酯如三棕櫚酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、三硬脂酸 甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三花生酸甘油酯或其混合物組成。根據(jù)特別 優(yōu)選的實(shí)施方案，所述固體核芯包括三棕櫚酸甘油酯（三棕櫚精，tripalmitin)。
[0066] 所述脂質(zhì)組分優(yōu)選包括至少一種C12_C24脂肪酸，其烴鏈可以是飽和或不飽和的、 直鏈或支鏈的。優(yōu)選地，所述脂肪酸選自：肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、山崳酸或其混合物。 所述核芯任選地包括(：12-(：24脂肪酸與c12-c24脂肪醇的單酯或二酯。脂肪酸酯組分可以進(jìn) 一步例如通過(guò)鯨蠟基棕櫚酸酯代表。
[0067] 優(yōu)選的脂質(zhì)組合是三棕櫚精和硬脂酸。
[0068] 根據(jù)可選的實(shí)施方案，a)中的脂質(zhì)組分可以包括在水中不溶但是在有機(jī)溶劑中可 溶的其它脂質(zhì)。例如，所述脂質(zhì)可以為酯化的聚（丙烯酸）或酯化的聚（乙烯醇）。尤其 是所述脂質(zhì)可以為被一種或多種醇全部或部分酯化的聚（丙烯酸）。在一個(gè)方面，使少于 全部的丙烯酸殘基酯化。在另一方面，將基本上全部丙烯酸殘基酯化。所述聚合物可以為 均聚物或共聚物。在一個(gè)方面，所述脂質(zhì)可以包含至少一種(： 4_(：24醇。在一個(gè)方面，所述醇 可以是飽和或不飽和的，可以是直鏈或支鏈的，且可以是未取代或取代的。每個(gè)丙烯酸殘基 處的醇可以相同或可以不同。在另一實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)可以為用一種或多種羧酸全部 或部分酯化的聚（乙烯醇）。在一個(gè)方面，使少于全部的或基本上全部的乙烯醇?xì)埢セ?所述聚合物可以是均聚物或共聚物。在各乙烯醇?xì)埢幍聂人峥梢韵嗤虿煌?br>[0069] 在SLN中，所述脂質(zhì)組分為固體和呈無(wú)定形或晶體形式。
[0070] 根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述固體核芯包括三棕櫚精和硬脂酸且為晶體。
[0071] 關(guān)于組分b)，本發(fā)明包括使用兩親性化合物作為