治療性融合蛋白的制作方法
【專利說(shuō)明】治療性融合蛋白
[0001]本發(fā)明設(shè)及一種融合蛋白，其包含針對(duì)Αβ的抗體、結(jié)合血腦屏障受體的單價(jià)結(jié)合 實(shí)體、和中性溶酶(η巧rilySin)結(jié)構(gòu)部分。
[000^背景
[0003] 在癡呆癥（dementia)的所有病例中約70%是由于阿爾茨海默病(Alzheimer's disease)引起的，其與對(duì)于認(rèn)知關(guān)鍵性的腦區(qū)域和神經(jīng)回路的選擇性損傷有關(guān)。阿爾茨海 默病的特征在于神經(jīng)纖維纏結(jié)，特別是在海馬錐體神經(jīng)元中的神經(jīng)纖維纏結(jié)，和眾多主要 包含淀粉樣蛋白沉積和緩和暈圈（defusedhalos)的致密核屯、的淀粉樣蛋白斑。
[0004] 細(xì)胞外神經(jīng)斑包含大量的主要是稱為"的定粉樣蛋白"、"A-護(hù)、"Αβ4"、"β-Α4"或"A 護(hù)的原纖維膚；參見Selkoe( 1994)，Ann.Rev.CellBio. 10,373-403，Κοο( 1999)，PNAS Vol. 96，卵.9989-9990，US4,666，829或Glenner(1984)，B服C12，1131。運(yùn)一淀粉樣蛋白來(lái) 源于"阿爾茨海默前體蛋白/P-淀粉樣蛋白前體蛋白"（APPKAPPs是膜內(nèi)在糖蛋白（參見 Sisodia(1992)，PNAS￥〇1.89，口口.6075)，并且由質(zhì)膜蛋白酶、曰-分泌酶在4口序列內(nèi)內(nèi)源性 蛋白水解切割(參見Sisodia(1992)Joe.cit.)。此外，其他分泌酶活性，特別是β-分泌酶和 丫-分泌酶活性導(dǎo)致包含39個(gè)氨基酸(A盼9)、40個(gè)氨基酸(ΑΜ0)、42個(gè)氨基酸(ΑΜ2)或43個(gè) 氨基酸(AM3)的淀粉樣蛋白-β(Αβ)的細(xì)胞外釋放；參見51扯曰（1999)，？歴5 96，11094-1053;Price(1998)'Science282,1078至1083;W0 00/72880或Hardy(1997)，TINS20,154。
[0005] 注意Αβ具有幾種天然存在的形式，其中人形式參見上文提及的Αβ39、ΑΜ0、Αβ41、Α 042和ΑΜ3。ΑΜ2是最突出的形式，其具有下述氨基酸序列(從Ν-端開始）：
[0006] DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(Seq.Id.No.1)〇
[0007] 在Αβ41、Αβ40、Αβ39中，分別缺少C端氨基酸A、IA和VIA。在Αβ43-形式中，在上述序 列（Seq.Id.No. 1)的C端包含另外一個(gè)蘇氨酸殘基。
[0008] 證明使AM0原纖維成核需要的時(shí)間顯著長(zhǎng)于使AM2原纖維成核的時(shí)間；參見 P.T丄ansbury，Jr.和J.D.化；rper(1997)，Ann.Rev.Biochem.66，385-407。如Wa即er(1999)， J.Clin.Invest. 104，1239-1332中總結(jié)的，AM2更常見與神經(jīng)炎性斑相關(guān)，并且被認(rèn)為在體 外更加是導(dǎo)致原纖維形成的。還提示Αβ42作為有序的非結(jié)晶Αβ膚的成核依賴性聚合中的 "晶種"；1993)，Cell93,1055-1058。修飾的ΑΡΡ加工和/或產(chǎn)生包含蛋白質(zhì)樣沉積 的細(xì)胞外斑塊不僅從阿爾茨海默病理學(xué)獲知，還從患有其他神經(jīng)學(xué)和/或神經(jīng)變性病癥的 受試者獲知。特別地，運(yùn)些病癥包括唐氏綜合征(Down'ssyn化ome)，荷蘭型遺傳性腦出血 伴淀粉樣變(Hereditarycerebralhemorrha邑ewithamyloidosisDutchtype)，中白金森 ?。≒arkinson'sdisease)，ALS(肌萎縮側(cè)索硬化（amyohophiclateralsclerosis))， 克-雅?。–reutzfeldJacobdisease),HIV-相關(guān)的癡呆化IV-relateddementia)和運(yùn)動(dòng) 神經(jīng)病(motorneuropathy)。
[0009] 直到現(xiàn)在，僅描述了有限的用于淀粉樣蛋白相關(guān)的疾病的醫(yī)藥干預(yù)方案。例如，已 經(jīng)討論膽堿醋酶抑制劑，如加蘭他敏(ga1antamine)，利斯的明（rivastigmine)或多奈贓齊 (donepezil)，在僅具有輕度至中度疾病的阿爾茨海默患者中是有益的。然而，由于運(yùn)些藥 物的膽堿能作用，也報(bào)告了不利事件。盡管運(yùn)些膽堿能-增強(qiáng)性治療確實(shí)產(chǎn)生一些癥狀益 處，但是對(duì)于所治療的大部分患者，治療響應(yīng)并不令人滿意。已經(jīng)估計(jì)僅在約5%的治療患 者中發(fā)生顯著的認(rèn)知改善，并且?guī)缀醪淮嬖谧C明治療顯著改變?cè)撨M(jìn)行性疾病的病程的證 據(jù)。
[0010] 因此，對(duì)于更有效的治療，特別是可W停滯或延緩疾病進(jìn)展的那些治療存在極大 的臨床需求。此外，最近W來(lái)，已經(jīng)使用了NMDA-受體括抗劑，如美金剛(memantine)。
[0011] 然而，已經(jīng)報(bào)道了由于藥理學(xué)活性導(dǎo)致的不利事件。此外，所述使用運(yùn)些醒DA-受 體括抗劑的治療僅可W視為癥狀性方法，而不能視為是疾病減輕的方法。
[0012]還已經(jīng)提議了用于治療淀粉樣蛋白相關(guān)的病癥的免疫調(diào)節(jié)方法。W0 99/27944公 開了包含Αβ膚的部分和載體分子的綴合物，由此所述載體分子應(yīng)該增強(qiáng)免疫應(yīng)答。W0 00172880中提及另一種活性免疫調(diào)節(jié)方法，其中也使用Αβ片段來(lái)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
[0013] 此外，W0 99/27944或W0 01/62801中提議了使用通用抗-Αβ抗體的被動(dòng)免疫方法， 并且W0 02/46237，W0 02/088306和W0 02/088307中描述了針對(duì)Αβ的部分的特異性人源化 抗體。W0 00177178描述了結(jié)合β-淀粉樣蛋白在水解過(guò)程中所采用的過(guò)渡形態(tài)的抗體。W0 03/070760公開了識(shí)別A削太上的兩個(gè)不連續(xù)的氨基酸序列的抗體分子。
[0014]本發(fā)明基本的技術(shù)問題是提供醫(yī)學(xué)控制淀粉樣蛋白病癥的有效手段和方法，特別 是用于減輕需要醫(yī)學(xué)干預(yù)的患者中的有害淀粉樣蛋白斑的手段和方法。
[0015] 附圖簡(jiǎn)述
[0016] 圖1通過(guò)化ISA顯示在體外mAb31和Ξ功能性多膚化iGant與Αβ1-40纖維的結(jié)合。對(duì) 照抗體是小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體(小鼠TfR)。
[0017] 圖2通過(guò)FACS分析顯示在體外mAb31和Ξ功能性多膚化iGant與鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的 務(wù)主厶 臺(tái)口口 〇
[001引圖3顯示中性溶酶（R&DSystems，Cat.No1182-ZNC)和Ξ功能性多膚TriGant的體 外酶活性。
[0019]圖4顯示與來(lái)自阿爾茨海默病患者的腦切片的天然人β-淀粉樣蛋白斑結(jié)合的 mAb31和Ξ功能性多膚TriGant的免疫組織化學(xué)染色。
[0020]圖5顯示在阿爾茨海默病小鼠模型中通過(guò)mAb31和Ξ功能性多膚TriGant的體內(nèi)β-淀粉樣蛋白斑裝飾(decoration) 〇GAH555 =綴合到Alexa555染料(MolecularProbes)上的 山羊抗-人IgG巧+L)dBAP-2 =針對(duì)綴合到Alexa488上的Αβ的小鼠單克隆抗體。
[0021] 發(fā)明實(shí)施方案的詳述
[0022] 在第一方面，本發(fā)明提供一種融合蛋白，其包含針對(duì)Αβ的抗體、結(jié)合血腦屏障受體 的單價(jià)結(jié)合實(shí)體、和中性溶酶結(jié)構(gòu)部分(moiety)。
[0023]在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述血腦受體選自由W下組成的組:轉(zhuǎn)鐵蛋白 受體，膜島素受體，膜島素樣生長(zhǎng)因子受體，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白8，低密度脂蛋白受 體相關(guān)蛋白1和肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子。
[0024] 在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述融合蛋白的單價(jià)結(jié)合實(shí)體是血腦屏障配體 或單價(jià)抗體片段，優(yōu)選地選自scFv，F(xiàn)v，sci^ibJab，V皿。
[0025]在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含：
[00%]-針對(duì)Αβ的抗體，其包含兩條重鏈和兩條輕鏈，
[0027]-結(jié)合血腦屏障受體的單價(jià)結(jié)合實(shí)體，其通過(guò)第一接頭偶聯(lián)到所述針對(duì)Αβ的抗體 的第一條重鏈的c-末端部分，和
[0028] -中性溶酶結(jié)構(gòu)部分，其通過(guò)第二接頭偶聯(lián)到所述針對(duì)Αβ的抗體的第二條重鏈的 C-末端部分。
[0029] 在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含：
[0030] -針對(duì)Αβ的抗體，其包含兩條重鏈和兩條輕鏈，
[0031] -結(jié)合血腦屏障受體的單價(jià)結(jié)合實(shí)體，其通過(guò)第一接頭偶聯(lián)到所述針對(duì)Αβ的抗體 的第一條重鏈化部分的C-末端，和
[0032] -中性溶酶結(jié)構(gòu)部分，其通過(guò)第二接頭偶聯(lián)到所述針對(duì)Αβ的抗體的第二條重鏈Fc 部分的C-末端。
[0033] 在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述融合蛋白的第一和第二接頭是膚或化學(xué)接 頭。
[0034] 在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述融合蛋白的單價(jià)結(jié)合實(shí)體是針對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白 受體的sci^ib。
[0035] 在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述融合蛋白針對(duì)Αβ的抗體包含：（a)H-CDRl， 其包含Seq.Id.No.5的氨基酸序列，（b)H-CDR2,其包含Seq.Id.No.6的氨基酸序列，（c)H-CDR3,其包含Seq.Id.No.7的氨基酸序列，（d化-CDR1，其包含Seq.Id.No.8的氨基酸序列， (e化-CDR2，其包含Seq.Id.No.9的氨基酸序列，和（f化-CDR3，其包含Seq.Id.No.10的氨基 酸序列。
[0036] 在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述融合蛋白針對(duì)Αβ的抗體包含：含有 Seq.Id.No. 3的氨基酸序列的Vh結(jié)構(gòu)域和含有Seq.Id.No. 4的氨基酸序列的化結(jié)構(gòu)域。
[0037] 在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述融合蛋白針對(duì)Αβ的抗體的第一條重鏈包含 第一個(gè)二聚化模塊，并且所述融合蛋白針對(duì)Αβ的抗體的第二條重鏈包含第二個(gè)二聚化模 塊，其允許運(yùn)兩條重鏈的異源二聚體化。
[0038] 在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，依據(jù)凸起進(jìn)入孔桐的策略，所述融合蛋白針對(duì)A 0的抗體的第一條重鏈的第一個(gè)二聚化模塊包含凸起，并且所述融合蛋白針對(duì)Αβ的抗體的 第二條重鏈的第二個(gè)二聚化模塊包含孔桐。
[0039] 在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述融合蛋白的特征在于存在一個(gè)單一單位的 結(jié)合血腦屏障受體的單價(jià)結(jié)合實(shí)體，優(yōu)選地，所述融合蛋白的特征在于存在一個(gè)單一的針 對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的SC化b。
[0040] 在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含：
[0041 ]-針對(duì)Αβ的抗體，其包含兩條重鏈和兩條輕鏈，
[0042] -單一單位的結(jié)合血腦屏障受體的單價(jià)結(jié)合實(shí)體，其通過(guò)第一接頭偶聯(lián)到所述針 對(duì)Αβ的抗體的第一條重鏈Fc部分的C-末端，優(yōu)選是單一單位的針對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的SC化b， 和
[0043] -單一單位的中性溶酶結(jié)構(gòu)部分，其通過(guò)第二接頭偶聯(lián)到所述針對(duì)Αβ的抗體的第 二條重鏈化部分的C-末端。
[0044] 在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述中性溶酶結(jié)構(gòu)部分來(lái)源于人中性溶酶 (Seq.Id.No. 2)，更特別地，所述中性溶酶結(jié)構(gòu)部分包含人中性溶酶的氨基酸52-750，即， Seq.Id.No.2的氨基酸52-750。
[0045] 在第二方面，本發(fā)明設(shè)及編碼本發(fā)明的融合蛋白的分離的核酸。
[0046] 在第Ξ方面，本發(fā)明設(shè)及包含本發(fā)明的分離的核酸的宿主細(xì)胞。
[0047] 在第四方面，本發(fā)明設(shè)及包含本發(fā)明的融合蛋白和藥用載體的藥物制劑。