復合生物活性因子的凍干方法及凍干粉的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物組織培養(yǎng)技術領域，尤其涉及一種復合生物活性因子的凍干方法 及凍干粉。
【背景技術】
[0002] 生物活性因子由多種細胞類型通過旁分泌、自分泌或內分泌的方式產(chǎn)生，能夠調 節(jié)細胞的生長、分化和免疫等功能，尤其能夠有效的與皮膚細胞發(fā)生作用，參與炎癥發(fā)生和 創(chuàng)傷愈合。例如：生物活性因子能夠促進上皮細胞的營養(yǎng)代謝，預防皮膚受到紫外線、自由 基等侵害；生物活性因子還能促使真皮層膠原細胞的增生，加速術后皮膚的修復。
[0003] 常見的細胞分泌的生物活性因子有EGF(中文；表皮生長因子，英文；epidermal growth factor)，BFGF(中文；堿性成纖維細胞生長因子，英文；basic fibroblast growth factor)，VEGF(中文；血管內皮生長因子，英文；vascular endothelial growth factor) 等。包含多種生活因子的組合體可W稱為復合生物活性因子。復合生物活性因子除了具備 各種生物活性因子自身的功能外，各種生物因子之間還可W相互促進，所W，復合生物活性 因子在醫(yī)療和化妝品等行業(yè)具有重要作用。
[0004] 復合生物活性因子的保存方法直接影響其生物活性的高低W及保存時間的長短， 進而影響復合生物活性因子的應用。對于生物制品，常見的保存方法有冷凍干燥保存方法， 冷凍干燥又稱升華干燥，是將需要干燥的物料溶液預先凍結成固體，然后在低溫低壓條件 下，從凍結狀態(tài)不經(jīng)過液態(tài)而直接升華去除水分的一種干燥方法。此過程中物料的干燥是 在凍結狀態(tài)下完成的，所W物料的組織結構和外觀形態(tài)將會被較好地保存。
[0005] 現(xiàn)有技術也不乏利用冷凍干燥方法獲取的生物制品，例如，公開號為 CN101444619A的專利，提供了一種不含人血白蛋白的細胞因子凍干制劑配方，并具體公開 了該配方的組成為：
[0006] 蠶組人干挽素a 2b; 5腑巧IU/放L 甘蘊醇; 4.0%
[0007] 吐潑織： 斯村?。?甘氯酸： 2.0% 罐發(fā)鹽纔沖液〇pH7.0): 50mM。
[0008] 再例如，公開號為CN103251649A的專利提供一種人間充質干細胞培養(yǎng)上清液凍 干粉及其制備方法，并具體公開了該凍干粉的制備過程為；在超凈工作臺中用50mL無菌離 必管收集低傳代數(shù)的人間充質干細胞培養(yǎng)液上清液，在4°C，400g離必15min ;在超凈工作 臺中打開離必管，用無菌槍頭吸出離必管中的上清液至一無菌的收集管中，棄沉淀，記錄標 志，-8(TC凍存凝固備用；將-8(TC凍存凝固的上清液抽真空，升華干燥，除去冰晶。最后制 得凍干粉，-2(TC保存。將篩選合適的陽性菌株進行擴大化培養(yǎng)，離必收集菌體，用細胞裂解 液裂解后經(jīng)超聲破碎，離必收集上清，陽離子交換層析粗提融合蛋白。層析峰上Ni金屬親 和層析提純融合蛋白，收集蛋白峰過Se地adex G50柱除鹽，獲得目標蛋白。
[0009] 但是現(xiàn)有技術公開的冷凍干燥方法都存在一些缺陷，不利于復合生物活性因子的 凍干保存，例如，在公開號為CN101444619A的專利中，采用了吐溫系列，該系列物質有溶血 作用，會限制復合生物活性因子凍干粉后期的使用；并且凍干過程中加有磯酸鹽緩沖液，其 中含有大量的鹽分，會降低復合生物活性因子的活性。公開號為CN103251649A的專利中， 在升華干燥前液體需要-8(TC凍存凝固，非常耗費能量，導致成本增加；并且獲得的凍干粉 需要-2(TC保存，保存條件非?？量蹋焕诒４婧瓦\輸。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明的主要目的在于，提供一種復合生物活性因子的凍干方法及凍干粉，提高 復合生物活性因子凍干粉的生物活性和穩(wěn)定性，且能夠在冷藏或者常溫下保存較長時間。
[0011] 為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0012] 一方面，本發(fā)明實施例提供一種復合生物活性因子的凍干方法，包括：
[0013] 將保護劑與5-10份包含復合生物活性因子的溶液混合所得的混合液依次經(jīng)過預 凍、加強預凍、升華干燥和解析干燥處理；
[0014] 其中，所述保護劑包括5-10份多元醇，所述混合液除所述保護劑和復合生物活性 因子溶液之外的其余部分為純凈水。
[0015] 優(yōu)選的，所述復合生物活性因子溶液至少包括；人表皮生長因子hEGF、血管內 皮生長因子VEGF、成纖維細胞生長因子FGF、轉化生長因子-目ITGF-目1、轉化生長因 子-目2TGF-目2、類膜島素一號增長因子IGF-1、類膜島素二號增長因子IGF-2、角質細胞生 長因子KGF、血小板衍生生長因子PDGF。
[001引優(yōu)選的，所述預凍的目標溫度為-30--5(TC，時長為1-2小時；
[0017] 所述加強預凍的目標溫度為-30 - -5(TC，時長為1-2小時。
[0018] 優(yōu)選的，所述升華干燥包含H個階段，其中，第一階段的目標溫度為-2(TC--1(TC，時長為5-8小時，真空度為150-300mT ;第二階段的目標溫度為-5°C -5°C，時長 為1-3小時，真空度為100-250mT ;第立階段的目標溫度為5°C -15。時長為1-3小時， 真空度為50-150mT ;所述解析干燥的目標溫度為2(TC -30。時長為3-6小時，真空度為 lO-lOOmT。
[0019] 優(yōu)選的，所述保護劑還包括3-5份的氨基酸，其中，所述多元醇包括山梨醇或甘露 醇中的一種或兩種；所述氨基酸包括甘氨酸或谷氨酸的一種或兩種；
[0020] 優(yōu)選的，所述保護劑還包括1-3份的聚合物，其中，所述多元醇包括山梨醇或甘露 醇中的一種或兩種；所述聚合物包括聚己帰化咯焼麗PVP、右旋糖巧、聚己二醇和明膠中的 一種或多種。
[0021] 優(yōu)選的，所述保護劑還包括0. 5-1份的糖和0. 4-1份的聚合物；其中，所述多元醇 包括山梨醇或甘露醇中的一種或兩種；所述聚合物包括聚己帰化咯焼麗PVP、右旋糖巧、聚 己二醇和明膠中的一種或多種；所述糖包括葡萄糖、乳糖、藏糖、和海藻糖中的一種或多種。
[0022] 另一方面，本發(fā)明實施例提供一種復合生物活性因子凍干粉，所述復合生物活性 因子凍干粉的配方包括：5-10份多元醇，W及0. 005-0.0 l份的復合生物活性因子，所述復 合生物活性因子至少包含；人表皮生長因子hEGF、血管內皮生長因子VEGF、成纖維細胞生 長因子FGF、轉化生長因子-目lTGF-目1、轉化生長因子-目2TGF-0 2、類膜島素一號增長 因子IGF-1、類膜島素二號增長因子IGF-2、角質細胞生長因子KGF、血小板衍生生長因子 PDGF。
[0023] 優(yōu)選的，所述復合生物活性因子凍干粉的配方還包括3-5份的氨基酸和1-3份的 聚合物，其中，所述多元醇包括山梨醇或甘露醇中的一種或兩種；所述氨基酸包括甘氨酸或 谷氨酸的一種或兩種；所述聚合物包括聚己帰化咯焼麗PVP、右旋糖巧、聚己二醇和明膠中 的一種或多種。
[0024] 優(yōu)選的，所述復合生物活性因子凍干粉的配方還包括0. 5-1份的糖和0. 4-1份的 聚合物，其中，所述多元醇包括山梨醇或甘露醇中的一種或兩種；所述聚合物包括聚己帰化 咯焼麗PVP、右旋糖巧、聚己二醇和明膠中的一種或多種；所述糖包括葡萄糖、乳糖、藏糖、 和海藻糖中的一種或多種。
[00巧]本發(fā)明實施例提供的一種復合生物活性因子的凍干方法，通過選擇有效的保護 劑，并合理配置保護劑與復合生物活性因子溶液的配比，然后通過預凍、加強預凍、升華干 燥和解析干燥處理，獲得復合生物活性因子凍干粉，該方法工藝簡單，成本合理，整個凍干 周期僅需要15-20小時，且所得復合生物活性因子凍干粉所含的生物活性因子的活性可W 保持70-80%，并且可冷藏或是室溫保存1-2年，極大地改善了保存條件的要求。
[0026] 本發(fā)明實施例提供的復合生物活性因子凍干粉，包含9種生物活性因子和凍干保 護劑，可W有效的與皮膚細胞發(fā)生作用，促進上皮細胞的營養(yǎng)代謝，預防皮膚受到紫外線、 自由基等侵害，還可W促使真皮層膠原細胞的增生。因此對皮膚術后可W加速修復，并具有 撫平細紋，延緩皮膚老化等功能。
【附圖說明】
[0027] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例描述 中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些 實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可W根據(jù)送些附 圖獲得其它的附圖。
[0028] 圖1為本發(fā)明實施例所得的凍干曲線圖；
[0029] 圖2為本發(fā)明實施例中利用基因表達方式檢測復合生物活性因子凍干前和凍干 后的生物活性的檢測結果示意圖。
【具體實施方式】
[0030] 現(xiàn)將詳細地提供本發(fā)明實施方式的參考，其一個或多個實例描述于下文。提供每 一實例作為解釋而非限制本發(fā)明。實際上，對本領域技術人員而言，顯而易見的是，可W對 本發(fā)明進行多種修改和變化而不背離本發(fā)明的范圍或精神。例如