，加入MTT(5.0 mg/ mUlO yL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入150 yL DMSO溶解生成的結(jié)晶子，用酶標(biāo)儀于492 nm處 測(cè)其吸光度值(A)，以培養(yǎng)基空白孔調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞存活率。
[0062] 附圖8是上述載藥的聚合物PEG5k-b-PCDC2.8k交聯(lián)納米粒子對(duì)Raw264.7和MCF-7 細(xì)胞的毒性結(jié)果圖；從結(jié)果可以看出，載阿霉素的交聯(lián)納米粒子對(duì)Raw264.7細(xì)胞的半致死 濃度為4.89 yg/mL，載阿霉素的交聯(lián)納米粒子對(duì)MCF-7細(xì)胞的半致死濃度為2.31 yg/mL，所 以載DOX的PEG5k-b-PCDC2.8k交聯(lián)納米粒子能有效的在細(xì)胞內(nèi)釋放藥物并殺死癌細(xì)胞。 [0063] 實(shí)施例十八聚合物納米粒PEG5k-P(CDC3.2k-c〇-TMBPEC3.5k)的制備、交聯(lián)、解交 聯(lián)及細(xì)胞毒性 納米粒子采用透析法制備。聚合物PEG5k-P(CDC3.2k-c〇-TMBPEC3.5k)溶解在N，N-二甲 基甲酰胺(5 mg/mL)中，取200 yL滴加到800 yL磷酸鹽緩沖溶液（10 mM，pH 7.4，PB)中，裝 入透析袋(MWCO 3500)中透析過(guò)夜，換五次水，透析介質(zhì)為I3B(H) mM，pH 7.4)。最終得到的 聚合物納米粒為膠束結(jié)構(gòu)，其濃度為〇 . 2 mg/mL。附圖9為聚合物PEG5k-P(CDC3.2k-c〇-TMBPEC3.5k)交聯(lián)納米粒子粒徑分布圖及電子投射顯微鏡圖片圖；可以看出，由動(dòng)態(tài)光散射 粒度分析儀(DLS)測(cè)的形成的納米膠束為60 nm，并且粒徑分布很窄；由透射電子顯微鏡可 以看出，交聯(lián)的納米粒子為球狀，并且分散均勻，尺寸與DLS所測(cè)相吻合。
[0064] 納米粒的交聯(lián)按加催化量的二硫代蘇糖醇(DTT)進(jìn)行。將聚合物納米粒水溶液通 氮?dú)?0分鐘，盡量將空氣趕凈。然后向密閉反應(yīng)器中的納米粒溶液（I mL，0.25 mg/mL， 3.21ΧΠΓ5 mmol)中加入10 yL溶解在二次水中的二硫代蘇糖醇(DTT)(0.007 mg，4.67X HT5 mmol，硫硫五元環(huán)摩爾數(shù)10 %)，密閉室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1天。測(cè)定粒子的尺寸為55納米，和 沒(méi)有交聯(lián)的粒徑相比減少約8%。這是因?yàn)榻宦?lián)之后的納米粒子相對(duì)于沒(méi)有交聯(lián)的納米粒子 核內(nèi)更緊實(shí)。交聯(lián)后的納米粒子在濃度稀釋100倍以后其粒徑和粒徑分布幾乎沒(méi)有變化;在 生理?xiàng)l件下穩(wěn)定，由此可以看出，雙硫交聯(lián)可以很大程度上提高納米粒的穩(wěn)定性。
[0065] 二硫鍵可以很容易在還原劑如谷胱甘肽作用下斷裂。在氮?dú)獗Ｗo(hù)和37 °C條件下， 將交聯(lián)納米粒溶液通氮?dú)?0分鐘后，加入谷胱甘肽(GSH)使其在聚合物納米粒子溶液中的 最終濃度為10 mM。利用動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀跟蹤納米粒子解交聯(lián)粒徑的變化情況。加 10 mM還原性物質(zhì)谷胱甘肽(GSH)后，交聯(lián)納米粒子粒徑隨著時(shí)間的推移逐步被破壞，說(shuō)明 聚合物中雙硫環(huán)在大量還原物質(zhì)存在下會(huì)斷裂。在細(xì)胞質(zhì)中也存在高濃度的GSH，因此制備 的納米藥物載體循環(huán)穩(wěn)定，但被細(xì)胞內(nèi)吞后能快速解離，釋放藥物. 采用MTT法對(duì)交聯(lián)納米粒的細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)試。使用到的細(xì)胞為HepG2(人肝癌細(xì)胞） 細(xì)胞和Raw 264.7(小鼠巨噬細(xì)胞）細(xì)胞。以IX IO4個(gè)/mL將MCF-7(人肝癌細(xì)胞)細(xì)胞或Raw 264.7(小鼠巨噬細(xì)胞)細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 yL，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入含 有不同濃度的聚合物納米粒的培養(yǎng)液，另設(shè)細(xì)胞空白對(duì)照孔和培養(yǎng)基空白孔，平行4個(gè)復(fù) 孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后取出96孔板，加入MTT (5.0 mg/mL)10 yL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后每 孔加入150 yL DMSO溶解生成的結(jié)晶子，用酶標(biāo)儀于492 nm處測(cè)其吸光度值(A)，以培養(yǎng)基 空白孔調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞存活率。
[0066] 式中At為試驗(yàn)組490 nm處的吸光度，Ac為空白對(duì)照組492 nm處的吸光度。聚合物濃 度分別為〇 .3，0.6,0.9,1.2,1.5 mg/mL。附圖10為納米粒細(xì)胞毒性結(jié)果，從圖中可以看出， 當(dāng)聚合物納米粒的濃度從0.3 mg/mL增大到1.5 mg/mL時(shí)，孵育24小時(shí)后HepG2和MCF-7細(xì)胞 的存活率仍高于85%，說(shuō)明PEG5k-P(CDC3.2k-c〇-TMBPEC3.5k)聚合物納米粒具有良好的生 物相容性。
[0067] 實(shí)施例十九交聯(lián)納米粒PEG5k-P(CDC3.2k-c〇-TMBPEC3.5k)的載阿霉素、體外釋 放及細(xì)胞毒性 PEG5k-P(CDC3.2k-c〇-TMBPEC3.5k)交聯(lián)納米粒裝載阿霉素、體外釋放方法同實(shí)施例十 七。采用MTT法對(duì)其形該交聯(lián)載藥納米粒對(duì)Raw264.7和HepG2等細(xì)胞的毒性進(jìn)行測(cè)試，載藥 的未交聯(lián)納米粒及游離藥物作為對(duì)照。以Raw264.7為例，將Raw264.7以I X IO4個(gè)/mL接種于 96孔板，每孔100 yL，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別加入含有0.01、0.1、1、5、10、50和100 yg/mL的載阿霉素交聯(lián)納米粒溶液，載阿霉素未交聯(lián)納米粒溶液及游離阿霉素的新鮮培養(yǎng) 液，另設(shè)細(xì)胞空白對(duì)照孔和培養(yǎng)基空白孔，每孔設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后取出96 孔板，加入10 yL的MTT(5.0 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入150 yL的DMSO溶解生成的 結(jié)晶子，用酶標(biāo)儀于492 nm處測(cè)其吸光度值(A)，以培養(yǎng)基空白孔調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié) 果見(jiàn)附圖11，載阿霉素的交聯(lián)納米粒對(duì)Raw264.7細(xì)胞的半致死濃度為12.8 yg/mL，相對(duì)于 游離阿霉素，只增大了不到十倍，所以載藥的PEG5k-P (CDC3.2k-c〇-TMBPEC3.5k)交聯(lián)納米 粒能有效在細(xì)胞內(nèi)釋放藥物并殺死癌細(xì)胞，而對(duì)應(yīng)的空交聯(lián)納米粒對(duì)HepG2和Raw264.7細(xì) 胞有很好的生物相容性。
[0068] 實(shí)施例二十cRGD修飾的腫瘤靶向的載藥聚合物納米粒cRGD-PEG5k_P(CDC3.2k_ c〇-TMBPEC3.5k )的制備及細(xì)胞毒性 按照實(shí)施例九中方法合成Mal-PEG6k-P(CDC3.8k-c〇-TMBPEC3.5k)聚合物，并按照實(shí)施 例十五中所述方法制備裝載DOX的納米粒，并按照實(shí)例十六中所述方法制備交聯(lián)載藥納米 粒。之后用cRGD-SH短肽通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)制備表面偶聯(lián)cRGD的納米粒子，其能被惡性膠 質(zhì)瘤細(xì)胞特異性內(nèi)吞，從而更有效地殺死腫瘤細(xì)胞，達(dá)到化學(xué)治療的效果。按照實(shí)施例十九 細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)方法，此處我們選用惡性腦膠質(zhì)瘤(U87MG細(xì)胞)細(xì)胞做MTT毒性試驗(yàn)，這是 因?yàn)檫@種細(xì)胞表面有對(duì)cRGD過(guò)度表達(dá)的整合蛋白，通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果可知，納米粒子 中cRGD- PEG6k-P(CDC3.8k-c〇-TMBPEC3.5k)在整個(gè)聚合物重量比為20%時(shí)，孵育了48小時(shí)， 并在加入載藥納米粒子4小時(shí)后吸走樣品，繼續(xù)孵育44小時(shí)，其藥物半致死量相對(duì)于沒(méi)有 cRGD的載藥納米粒子減少了六倍，由此結(jié)果可知，表面修飾cRGD的載藥納米粒子可以與細(xì) 胞表面特殊的受體結(jié)合并內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，相對(duì)于沒(méi)有靶向的納米粒子，其主動(dòng)靶向性很強(qiáng)， 能有效的殺死腫瘤細(xì)胞，在載藥納米粒子對(duì)腫瘤的靶向治療中有廣泛的應(yīng)用前景。
[0069] 實(shí)施例二^^一載藥PEG5k-PLGA7.8k-PCDCl.7k修飾納米金棒表面、及NIR觸發(fā)的 藥物釋放 三嵌段聚合物PEG5k-PLGA7.8k-P⑶Cl. 7k納米粒修飾的納米金棒的制備 在劇烈攪拌下，溶解在DMSO中的聚合物溶液(2 mL，5mg/mL)滴加到納米金棒的分散液 中（5 mL，O.lmg/mL)攪拌4小時(shí)，離心兩次除去沒(méi)有接上去的聚合物，再次分散在磷酸緩沖 溶液中，通過(guò)TGA來(lái)檢測(cè)修飾上金棒的聚合物產(chǎn)率，通過(guò)與單獨(dú)的聚合物相比，聚合物修飾 的金棒的產(chǎn)率為80%(理論按百分之一百投料）。聚合物修飾的納米金棒的載藥。在上述得到 的聚合物修飾的納米金棒溶液中，逐滴滴加10%，20%，30%的溶解在DMSO中的藥物，攪拌半小 時(shí)之后在室溫下孵育12 h，并通過(guò)透析12小時(shí)除去游離的小分子藥物，透析介質(zhì)為pH為7.4 的磷酸緩沖溶液，之后通過(guò)熒光檢測(cè)其對(duì)藥物的包裹效率為70~90%，由此可知，聚合物修飾 的納米金棒可以高效的包裹小分子疏水藥物。
[0070] NIR觸發(fā)的聚合物修飾的納米金棒的藥物釋放。聚合物修飾的納米金棒分散在10 mL磷酸緩沖溶液中，隔一小時(shí)用強(qiáng)度為0.2 W/cm2,波長(zhǎng)為808 nm的紅外光照射5 min，在 特定的時(shí)間間隔內(nèi)取500 nL溶液出來(lái)，離心，測(cè)上清液的熒光，由此分析釋放出來(lái)的小分子 藥物含量。通過(guò)熒光檢測(cè)可知，光照過(guò)后的聚合物修飾的納米金棒的藥物釋放為92%，遠(yuǎn)遠(yuǎn) 快于沒(méi)有光照的對(duì)照組(釋放僅為18%)，由此可知，此類聚合物修飾的納米金棒材料可應(yīng)用 于近紅外觸發(fā)的藥物釋放。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種側(cè)鏈含雙硫五元環(huán)功能基團(tuán)的碳酸醋聚合物在制備藥物控制釋放載體中的應(yīng) 用;所述側(cè)鏈含雙硫五元環(huán)功能基團(tuán)的碳酸醋聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：其中，R1選自W下基團(tuán)中的一種：所述側(cè)鏈含雙硫五元環(huán)功能基團(tuán)的碳酸醋聚合物的分子量為3000~70000 Da。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述側(cè)鏈含雙硫五元環(huán)功能基團(tuán)的碳酸醋聚合物在制備藥物控制釋 放載體中的應(yīng)用，其特征在于:所述側(cè)鏈含雙硫五元環(huán)功能基團(tuán)的碳酸醋聚合物分子鏈上 含有雙硫五元環(huán)功能基團(tuán)的環(huán)碳酸醋單體的單元數(shù)為4~50。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種側(cè)鏈含雙硫五元環(huán)功能基團(tuán)的碳酸酯聚合物在制備藥物控制釋放載體中的應(yīng)用。所述側(cè)鏈含雙硫五元環(huán)功能基團(tuán)的碳酸酯聚合物基于含有雙硫五元環(huán)功能基團(tuán)的環(huán)碳酸酯單體通過(guò)活性可控開(kāi)環(huán)聚合得到，其分子量可控、分子量分布較窄，無(wú)需保護(hù)和脫保護(hù)過(guò)程；利用本發(fā)明所述的環(huán)碳酸酯單體開(kāi)環(huán)聚合得到的聚合物具有生物可降解性，可用于控制藥物釋放體系，制備的腫瘤靶向的還原敏感可逆交聯(lián)的納米藥物載體支持體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)，但在癌細(xì)胞高富集并細(xì)胞內(nèi)快速解交聯(lián)、釋放出藥物，高效特異性地殺死癌細(xì)胞。同時(shí)該碳酸酯聚合物在組織工程支架和生物芯片涂層等方面具有應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61P35/00, A61K47/34, A61K31/704
【公開(kāi)號(hào)】CN105535983
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510973768
【發(fā)明人】孟鳳華, 鄒艷, 鐘志遠(yuǎn)
【申請(qǐng)人】蘇州大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2014年5月28日
【公告號(hào)】CN104031248A, WO2015180656A1