一種禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒亞單位疫苗注射復(fù)合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物免疫領(lǐng)域，提供了一種禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(REV)亞單位疫苗 注射復(fù)合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒(REV)是一種可引起感染雞免疫抑制和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生為主 的單股RNA病毒，與人艾滋病毒化IV)同屬;在我國及雞飼養(yǎng)量較大的國家和地區(qū)呈現(xiàn)規(guī)模 較大的流行，我國近S年廣西、安徽、江西等地流行病學(xué)調(diào)查表明，REV感染率均在30% W 上，僅次于馬立克氏病，呈現(xiàn)W二重或多重感染為主的流行趨勢，每年給我國養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán) 重的經(jīng)濟(jì)損失。該病毒在雞群中可垂直傳播和水平傳播，自然狀態(tài)下W前者為主，橫向傳播 多發(fā)生于免疫力低下的維雞或昆蟲叮咬W及污染的疫苗接種傳播;病毒雖為RNA病毒，但在 免疫選擇壓下不易發(fā)生變異，但易與其它DNA病毒發(fā)生重組而改變自身特性。自然感染狀態(tài) 下，REV引起感染雞產(chǎn)生腫瘤的比例并不高，而引發(fā)機(jī)體對疫苗反應(yīng)的降低、淋己細(xì)胞轉(zhuǎn)化 能力下降等免疫抑制最為多見，從而造成對其他病原的易感性增強(qiáng)。目前尚無有效的藥物 和市場化的疫苗來防治該病。
[0003] 崔治中曾報(bào)道使用致弱毒株感染種雞誘導(dǎo)產(chǎn)生母源抗體阻斷維雞的早期感染的 方法;最近報(bào)道使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)W及真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS對 REV囊膜基因 gp90進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)獲得具有一定免疫保護(hù)原性的重組蛋白，但W上方法都有 一定局限性，前者致弱的病毒免疫原具有返強(qiáng)和復(fù)壯的危險(xiǎn)，后者誘導(dǎo)所產(chǎn)生的抗體效價(jià) 仍舊偏低，仍不能產(chǎn)生足夠的保護(hù)力，另外研制過程復(fù)雜、技術(shù)性強(qiáng)、獲得表達(dá)產(chǎn)物少、成本 高等缺點(diǎn)也限制了該方法的臨床應(yīng)用。
[0004] 使用原核表達(dá)系統(tǒng)制備結(jié)構(gòu)簡單的重組蛋白仍是目前生產(chǎn)亞單位疫苗或免疫原 的主要方法，具有操作相對簡單、表達(dá)產(chǎn)物量大、易于純化、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但免疫原性相對 較低，人們往往使用免疫佐劑提高原核表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性。傳統(tǒng)免疫佐劑是油乳佐劑，能 夠提高滅活疫苗和蛋白抗原等的免疫原性和免疫保護(hù)能力，但與弱毒苗相比，仍存在很大 的差距，往往達(dá)不到生產(chǎn)臨床中需要的防治效果。因此如何獲得一種高效的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增 生癥病毒亞單位疫苗注射復(fù)合物成為亟待解決的問題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺失，本發(fā)明提供了一種禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(REV)亞 單位疫苗注射復(fù)合物及其制備方法，包括禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒(REV)亞單位疫苗抗原和對 應(yīng)的免疫佐劑，獲得上述抗原后與佐劑聯(lián)合免疫接種，其中亞單位疫苗的制備是根據(jù)REV囊 膜蛋白gp90基因設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增后得到目的基因，經(jīng)大腸桿菌等表達(dá)制備重組蛋白獲得疫 苗抗原，該重組抗原與硫代化核酸緩釋佐劑乳化混勻后，對禽鳥進(jìn)行免疫接種，能夠有效地 預(yù)防或治療禽鳥REV的感染，具有很好的商品化開發(fā)前景。
[0006] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
[0007] 一種禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒亞單位疫苗注射復(fù)合物，包括禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒亞 單位疫苗抗原和核酸緩釋佐劑，
[0008] 其中所述的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒亞單位疫苗抗原為gp90蛋白抗原，其制備方法是 通過設(shè)計(jì)的特異性引物：
[0009] 上游引物：5-CCGGAATTCTCCTCCATACCTACCTATTACA-3'其核巧酸序列如Seq ID No: 1所示；
[0010] 下游引物：5-46461'〔64口'〔447^6664616〇1^'61'-3其核巧酸序列如569 10齡：2所 示；
[00川擴(kuò)增REV囊膜蛋白即90的基因，構(gòu)建包含即90基因的原核表達(dá)質(zhì)粒重組質(zhì)粒REV-甜90-pET32a，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)純化后獲得；
[0012]所述的核酸緩釋佐劑其包括如下組分：全硫代修飾的5 ' -TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3 '核酸分子，其核巧酸序列如Seq ID No: 3所示；7號(hào)白油；硬 脂酸侶和司本80,其制備方法如下：
[001引7號(hào)白油和司本80分別按94%和6%體積比混合，之后將硬脂酸侶按2%質(zhì)量比加 入到上述混合物中，116°C高壓滅菌，冷卻至50°C，用力振搖至透明狀；
[0014] 之后再按10化g/mL添加的上述全部硫代化修飾的CpG-ODN,混勻，制備成油乳狀。
[0015] 其中甜90蛋白抗原的制備方法具體如下：
[0016] 將重組質(zhì)粒REV-即90-pET3^轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌體內(nèi)（DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得重組 甜90基因表達(dá)產(chǎn)物，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后甜90重組蛋白純度大于95 %。用PBS將即90重組蛋白 的濃度稀釋至2mg/mL，作為疫苗抗原，低溫保存?zhèn)溆谩?br>[0017] 除此之外，本發(fā)明還提供了所述禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒亞單位疫苗注射復(fù)合物的 制備方法，具體步驟如下：
[0018] 純化后的即90蛋白抗原用PBS稀釋至l.Omg/mL，之后按蛋白抗原:免疫佐劑按體積 比1:1混合，于振蕩器上震蕩1小時(shí)后，使用超聲破碎儀進(jìn)行乳化，超聲乳化的條件為:功率 為350W，工作時(shí)間3s，間歇時(shí)間2s，溫度控制在25 °C，至乳化完全后停止超聲。
[0019] 除此之外，還可W直接采用乳化機(jī)進(jìn)行乳化，
[0020] 判斷乳化完全的方法為：用注射器針頭薩取離屯、管內(nèi)的免疫原，甩針頭使液體滴 在預(yù)冷的水中，30min內(nèi)不擴(kuò)散即判斷為乳化完全。
[0021 ]乳化后的注射液可低溫(0-4 °C)下保存6-9個(gè)月。
[0022] 本發(fā)明提供了所述禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒亞單位疫苗注射復(fù)合物的使用方法如 下：
[0023] 按0.5mL/羽（只）肌肉或皮下注射，每間隔2-3周加強(qiáng)免疫一次，免疫2-3次即可產(chǎn) 生完全的免疫保護(hù)力。
[0024] 綜上所述，本發(fā)明獲得了一種禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(REV)亞單位疫苗注射復(fù)合 物及其制備方法，包括禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒(REV)亞單位疫苗抗原和對應(yīng)的免疫佐劑，獲得 上述抗原后與佐劑聯(lián)合免疫接種，其中亞單位疫苗的制備是根據(jù)REV囊膜蛋白gp90基因設(shè) 計(jì)的引物擴(kuò)增后得到目的基因，經(jīng)大腸桿菌等表達(dá)制備重組蛋白獲得疫苗抗原，該重組抗 原與硫代化核酸緩釋佐劑乳化混勻后，對禽鳥進(jìn)行免疫接種，能夠有效地預(yù)防或治療禽鳥 REV的感染，具有很好的商品化開發(fā)前景。
【附圖說明】
[0025] 圖1為REV甜90基因片段的擴(kuò)增結(jié)果示意圖，
[0026] 圖中M泳道條帶代表核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量；1泳道條帶代表所需擴(kuò)增的目的基因，由圖 可知通過設(shè)計(jì)的核酸引物，從含有REV gp90基因的模板中可W擴(kuò)增出與圖1中1泳道條帶大 小一致的目的基因片段；
[0027] 圖2為REV-甜90-pET3^i重組質(zhì)粒擴(kuò)增結(jié)果示意圖，
[0028] 圖中Ml和M2泳道條帶均代表核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量;1泳道條帶代表構(gòu)建重組質(zhì)粒大??； 2泳道條帶代表所構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶消化分解后的2個(gè)基因片段，由圖可知擴(kuò)增圖1中目 的基因片段與質(zhì)粒祀T32a連接后可得到用于表達(dá)抗原蛋白產(chǎn)物的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒大小與 圖2中1泳道的條帶大小是一致的;經(jīng)內(nèi)切酶消化后可得到與圖2中2泳道基因大小一致的兩 個(gè)片段；
[0029] 圖3為REV甜90重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白產(chǎn)物和蛋白純化結(jié)果示意圖，
[0030] 圖中M泳道中條帶代表蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；1泳道條帶代表不含重組質(zhì)粒的大腸桿菌 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物;2泳道條帶代表含重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白產(chǎn)物;3泳道條帶代表純化后的 重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物；由圖可知圖2中重組質(zhì)粒在大腸桿菌中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后可獲得與圖3泳 道1條帶對應(yīng)的蛋白產(chǎn)物，經(jīng)純化后獲得與泳道3中條帶對應(yīng)的蛋白產(chǎn)物；
[0031] 圖4為REV甜90重組蛋白鑒定結(jié)果示意圖，
[0032] 圖中M泳道條帶代表蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；1泳道條帶代表重組蛋白與REV單克隆抗體 免疫沉淀反應(yīng)后的結(jié)果，由圖可知圖3誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白是所需要的REV甜90重組蛋白；
[0033] 圖5為本發(fā)明所述禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒亞單位疫苗注射復(fù)合物分別接種雞后血 清中和抗體的變化結(jié)果示意圖；
[0034] 由圖可知用制備的圖4中REVgpgo重組蛋白與核酸緩釋佐劑混合形成的免疫接種 物能夠誘導(dǎo)雞只產(chǎn)生較高滴度的血清抗體(圖中淺灰色線），該免疫接種物較不含核酸緩釋 佐劑的REV甜90重組蛋白接種物所形成的血清抗體（圖中深黑色線)滴度要高得多，有顯著 差別（圖中小寫英文字母表示）；
[0035] 圖6為接種所述禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒亞單位疫苗注射復(fù)合物后的雞只病毒血癥 檢測結(jié)果示意圖；
[0036] 其中A為感染病毒CEF陽性對照;B為對照組雞只；C為即90組雞只；D為即90+CpG組 雞只，由圖可知接種REVgpgo重組蛋白與核酸緩釋佐劑混合物的雞只血液內(nèi)檢測不到病毒 (圖中D所示未見巧光），而沒有接種或僅接種REV gp90蛋白的雞只血液內(nèi)能夠檢測出病毒 存在（圖中B和C所示巧光），可見本發(fā)明所述禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒亞單位疫苗注射復(fù)合物 能夠預(yù)防雞只不被REV的感染；
[0037] 圖7為所述禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒亞單位疫苗注射復(fù)合物接