白細(xì)胞介素35在制備抗病毒藥物的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及白細(xì)胞介素35(interleukin-35，IL-35)的藥物新 用途，具體是其在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 白細(xì)胞介素-35是IL-12家族的新成員，由IL-27的β鏈EBI3(EB病毒誘導(dǎo)基因3)和 IL-12的α鏈P35組成，最早在BJAB B淋巴細(xì)胞、C0S7細(xì)胞及胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)分泌型的 EBI3及p35,2007年，研究人員在分子水平上將EBI3和p35通過(guò)3xGGGGS的柔性結(jié)合肽段連接 起來(lái)，并命名為IL-35JL-35的受體是由IL-12Ri32和gpl30組成的異源二聚體，或他們各自 形成的同源二聚體。在過(guò)敏性哮喘、多發(fā)性硬化癥、結(jié)節(jié)病等疾病中發(fā)現(xiàn)IL-35的表達(dá)。
[0003] I型干擾素包括IFNa、IFNP、IFN-δ、IFN-ε、IFN-δ、IFN-K、IFN-v、IFN-τ、和IFN- ω。I 型干擾素運(yùn)用兩條信號(hào)通路，Toll樣受體(TLRs)和胞衆(zhòng)受體(cytosolic receptor)。1型干 擾素有多種功能，例如抗病毒、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和免疫調(diào)節(jié)作用。III型干擾素 （Type III interferon，IFNs)，是一個(gè)新型的干擾素家族，坐落在第19號(hào)染色體ql3上，包括3種λ干擾 素：IFN-A1 (也被稱(chēng)為 IL-29)、IFN-X2(也被稱(chēng)為 IL-28A)和 IFN-X3(也被稱(chēng)為 IL-28B)<JII 型 干擾素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與I型干擾素類(lèi)似，激活Jak/STAT信號(hào)通路，轉(zhuǎn)錄多種IFN相關(guān)的基因。 III型干擾素的抗病毒功能與I型干擾素相比較弱，而且只能針對(duì)某些病毒種類(lèi)，如甲型流 感病毒、VSV、腦心肌炎病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒等。III型干擾素抑制病毒的復(fù)制保 護(hù)宿主細(xì)胞免于病毒感染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供IL-35在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明證明IL-35具有抗病毒作用。通過(guò)探討流感病毒感染后誘導(dǎo)IL-35上調(diào)表 達(dá)，促進(jìn)I型和III型干擾素表達(dá)的抗病毒作用機(jī)制；以及IL-35的廣譜抗病毒功效。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] IL-35在細(xì)胞和分子水平上對(duì)流感病毒復(fù)制有抑制作用，預(yù)示IL-35可以做為臨床 抗病毒藥物而進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。首先我們?cè)诩竟?jié)性流感病人的臨床樣本包括血液PBMC和咽 拭子中發(fā)現(xiàn)了 IL-35的高表達(dá)，且與流感病毒呈正相關(guān)。然后我們?cè)贏549細(xì)胞、人外周血淋 巴細(xì)胞和人肺泡二型原代細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)A型流感病毒感染時(shí)誘導(dǎo)IL-35在mRNA和蛋白水平 上的高表達(dá)。IL-35過(guò)表達(dá)或外源的rhIL-35都能激活I(lǐng)型和III型干擾素的表達(dá)，以及干擾 素誘導(dǎo)基因 PKR、0AS、Mx的表達(dá)進(jìn)而抑制病毒的復(fù)制，對(duì)包括EV71、VSV、IAV等病毒都具有抑 制病毒復(fù)制的作用?？傮w實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)了 IL-35能促進(jìn)免疫細(xì)胞產(chǎn)生干擾素且激活下游通 路而達(dá)到廣譜抗病毒效果的機(jī)制。
[0008] IL-35作為一種新的細(xì)胞因子，在多種疾病中發(fā)現(xiàn)有表達(dá)，其機(jī)制及與疾病的相互 關(guān)系將不斷被發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明揭示了 IL-35的一種新的生物學(xué)功能，能夠誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生干 擾素且激活干擾素下游通路進(jìn)而發(fā)揮廣譜抗病毒的作用，這一新發(fā)現(xiàn)為研制抗病毒藥物提 供理論基礎(chǔ)。
[0009]本發(fā)明作為開(kāi)發(fā)一種新的抗病毒因子IL-35的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0010] 本發(fā)明采用體內(nèi)天然存在的蛋白IL-35，促進(jìn)人體免疫細(xì)胞產(chǎn)生IFNa、正婦和正似 1，具有完備的生物學(xué)功能，且不用引入異源性的成分因而不會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生毒副作用。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖I: IL-35在A型流感病人臨床樣本中高表達(dá)
[0012] A.Real-time PCR檢測(cè)健康人和IAV病人血液PBMC中IL-35/EBI3mRNA(左）和IL-35/p35mRNA(右）；
[0013] B.Real-time PCR檢測(cè)健康人和IAV病人咽拭子中IL-35/EBI3mRNA(左）和IL-35/ p35mRNA(右）；
[0014] C.Pearson's correlation assay分析IAV病人血液PBMC中IL_35/EBI3mRNA與IAV NP mRNA相關(guān)性(左)和IL-35/p35mRNA與IAV NP mRNA相關(guān)性(右）。
[0015] 圖2:1六￥誘導(dǎo)幾-35在多種細(xì)胞中表達(dá)
[0016] A.不同劑量IAV感染A549細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞樣，Real-time PCR檢測(cè)IL-35mRNA;
[0017] Β· IAV(MOI = I)感染A549細(xì)胞，收集他、611、1211、2411、4811細(xì)胞，1^31-衍1116?0?檢測(cè) IL-35mRNA；
[0018] C.mock、滅活的IAV，IAV(MOI = I)感染A549細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，Real-time PCR 檢測(cè) IL-35mRNA;
[0019] D. IAV(MOI = I)感染A549細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞上清，ELISA檢測(cè)IL-35蛋白；
[0020] E .mock、滅活的 IAV，IAV(M0I = 0· 1)感染 PBMC 細(xì)胞，12h 后收集細(xì)胞，Real-time PCR 檢測(cè) IL-35mRNA;
[0021 ] F .mock、IAV(M0I = 1)感染AT-II細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，Real-time PCR檢測(cè)IL-35mRNA〇
[0022] 圖3:pCMV-IL-35的構(gòu)建和鑒定
[0023] A ·通過(guò)PCR技術(shù)將EBI3和p35連接插入pcDNA3 · 1 (-)載體上，構(gòu)成pCMV-IL-35;
[0024] 8.?〇1^-11^-35電轉(zhuǎn)了虹1^七細(xì)胞，1^&1-^1116?0?檢測(cè)11^-35/^813和11^-35/ p35mRNA；
[0025] C. IL-35ELISA試劑盒檢測(cè)B中培養(yǎng)上清的IL-35蛋白；
[0026] D·293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-IL-35，Westernblot分別用EBI3和p35的一抗檢測(cè)胞內(nèi)IL-35蛋白。
[0027] 圖4: IL-35誘導(dǎo)I型和III型干擾素表達(dá)
[0028] A. Jurkat細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染vector和pCMV-IL-35，24小時(shí)后收集Jurkat細(xì)胞，提取 RNA，Real-time 檢測(cè) IFNa、IFNP 和 IFNAl 的 mRNA;
[0029] B. PBMC細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染vector和pCMV-IL-35，24小時(shí)后收集PBMC細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi) 總 RNA，Real-t ime 檢測(cè) IFNa、IFNP 和 IFNAl 的 mRNA;
[0030] C. Jurkat過(guò)表達(dá)pCMV-IL-35或vector 36小時(shí)，收集上清液，孵育A549細(xì)胞12小 時(shí)，加 IAV (MO I = 1)感染12小時(shí)，收集細(xì)胞樣檢測(cè)PKR、OAS、Mx的mRNA;
[0031] D.同E實(shí)驗(yàn)，感染24小時(shí)，western blot檢測(cè)胞內(nèi)PKR、0AS、Mx的蛋白表達(dá);E.rhIL- 35刺激Jurkat細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，Real-time檢測(cè)IFNa、IFN0和IFNAl的mRNA;
[0032] F .mock或rhIL-35刺激Jurkat細(xì)胞24h，收集上清液，孵育A549細(xì)胞12小時(shí)，加 IAV (MOI = I)感染24小時(shí)，western blot檢測(cè)胞內(nèi)PKR、0AS、Mx的蛋白表達(dá)。
[0033] 圖5: IL-35通過(guò)Jurkat細(xì)胞間接抗病毒
[0034] Jurkat細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pCMV-IL-35和Vector，36小時(shí)后離心收集上清做抗病毒實(shí) 驗(yàn)。
[0035] A.A549細(xì)胞用Jurkat上清孵育 12小時(shí)，加入IAV(M0I = I)，Real-time PCR檢測(cè)胞 內(nèi)IAV三種RNA;
[0036] B.血凝實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上清中IAV的滴度；
[0037] C·RD細(xì)胞，用Jurkat上清孵育 12小時(shí)，加入EV71 (Μ0Ι = 1 )，Real-time PCR絕對(duì)定 量檢測(cè)EV71的拷貝數(shù)；
[0038] D · A549細(xì)胞用Jurkat上清孵育12小時(shí)，加入重組病毒VSV-eGFP(M0I = 1)，熒光顯 微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)；
[0039] E.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)E中GFP陽(yáng)性的細(xì)胞。
[0040] 圖6: IL-35通過(guò)PBMC間接抗病毒
[00411 PBMC分別轉(zhuǎn)染pCMV-IL-35和Vector，36小時(shí)后離心收集上清做抗病毒實(shí)驗(yàn)。
[0042] A·A549細(xì)胞用PBMC上清孵育12小時(shí)，加入IAV(M0I = I)，Real-time PCR檢測(cè)胞內(nèi) IAV 三種 RNA;
[0043] B.血凝實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上清中IAV的滴度；
[0044] C·RD細(xì)胞，用PBMC上清孵育12小時(shí)，加入EV71(Μ0Ι = 1 )，Real-time PCR絕對(duì)定量 檢測(cè)EV71的拷貝數(shù)；
[0045] D · Vero細(xì)胞用Jurkat上清孵育12小時(shí)，加入重組病毒VSV-eGFP(M0I = 1)，流式細(xì) 胞技術(shù)檢測(cè)GFP陽(yáng)性的細(xì)胞。
[0046] 圖7: rhIL-35的抗病毒作用
[0047] 以100ng/ml rhIL-35或?qū)φ誅MSO刺激Jurkat細(xì)胞24小時(shí)，收集上清進(jìn)行抗病毒實(shí) 驗(yàn)。
[0048] A.RD細(xì)胞，用Jurkat上清孵育 12小時(shí)，加入EV71(M0I = l)，Real-time PCR 絕對(duì)定 量檢